Изобретения в сфере сельского хозяйства, животноводства, рыболовства

 
Изобретения в сельском хозяйстве Обработка почвы в сельском и лесном хозяйствах Посадка, посев, удобрение Уборка урожая, жатва Обработка и хранение продуктов полеводства и садоводства Садоводство, разведение овощей, цветов, риса, фруктов, винограда, лесное хозяйство Новые виды растений или способы их выращивания Производство молочных продуктов Животноводство, разведение и содержание птицы, рыбы, насекомых, рыбоводство, рыболовство Поимка, отлов или отпугивание животных Консервирование туш животных, или растений или их частей Биоцидная, репеллентная, аттрактантная или регулирующая рост растений активность химических соединений или препаратов Хлебопекарные печи, машины и прочее оборудование для хлебопечения Машины или оборудование для приготовления или обработки теста Обработка муки или теста для выпечки, способы выпечки, мучные изделия

Способ криоконсервирования клеточных суспензий

 
Международная патентная классификация:       A01N

Патент на изобретение №:      2195111

Автор:      Костяев А.А., Утемов С.В.

Патентообладатель:      Государственное учреждение Кировский НИИ гематологии и переливания крови

Дата публикации:      27 Декабря, 2002

Начало действия патента:      16 Мая, 2001

Адрес для переписки:      610027, г.Киров, ул. Красноармейская, 72, Кировский НИИГиПК

Изобретение относится к медицине, а именно к способам консервирования замораживанием клеток костного мозга и компонентов крови человека. Способ консервирования клеточных суспензий осуществляют путем смешивания с криозащитным раствором в эластичной упаковке, поэтапного замораживания с выдерживанием упаковок в морозильной камере, в хладоагенте в виде раствора этилового спирта с фиксированной температурой холодовой адаптации и с последующим перемещением для замораживания в хранилище, при этом упаковку, заполненную на 10-20% помещают в раствор этилового спирта 38-40 об.% с температурой холодовой адаптации от -22 до -25oС, упаковку, заполненную на 25-30% помещают в раствор этилового спирта 42-45 об.% с температурой холодовой адаптации от -26 до -30oC с последующим замораживанием в хранилище при температуре от -40 до -80oC. Технический результат: способ обеспечивает прогнозируемые показатели сохранности жизнеспособности клеток.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

Изобретение относится к медицине, а именно к способам консервирования замораживанием клеток костного мозга и компонентов крови человека, и может найти применение в гематологических, онкологических, хирургических и других центрах для лечения больных с депрессией кроветворения и инфекционными осложнениями.

Известен способ консервирования клеток костного мозга в эластичных упаковках, заполненных на 10-30%, в охлажденном жидком хладагенте путем поэтапного замораживания в растворе этилового спирта 96 об.% с выдерживанием при температуре холодовой адаптации и последующего охлаждения до -40Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-50oС в морозильнике (Авт. св. 2144290, А 01 N 1/02). Этот способ взят в качестве прототипа. В нем использован экспоненциальный линейно-ступенчатый режим замораживания, повышающий сохранность и устойчивость любых открытых биологических систем (ОБС), в том числе, суспензии донорских клеток костного мозга, лейкоцитов и тромбоцитов к факторам криоповреждения.

Однако использование в технических целях раствора этилового спирта 96 об. % высокой очистки в качестве жидкого хладагента-выбора затратно и нежелательно, поскольку оказывает высокое токсическое воздействие на организм, а также является профессиональной и бытовой вредностью.

Кроме того, не выдерживается соотношение объема замораживаемых контейнеров с биосредой и объема жидкого хладагента в морозильной камере. Поэтому не представляется возможным стандартизировать условия консервирования клеточных суспензий замораживанием и тем самым повысить сохранность биологических объектов.

Задача изобретения: заменить раствор этилового спирта 96 об.% на дешевый и менее токсичный хладагент.

Другая задача изобретения состоит в необходимости стандартизировать условия криоконсервирования клеточных суспензий.

Цель изобретения - повысить сохранность клеток и экономичность их криоконсервирования.

Поставленная цель достигается тем, что в вышеописанном способе при замораживании упаковок, заполненных на 10-20%, и температуре холодовой адаптации -22Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-25oС используют в качестве жидкого хладагента раствор этилового спирта 38-40 об.%, а при замораживании упаковок, заполненных на 25-33,3%, и температуре холодовой адаптации -26Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-30oС в качестве жидкого хладагента используют раствор этилового спирта 42-45 об.%, при этом объем упаковки составляет 10% объема хладагента в морозильной камере.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

Суспензию клеток в растворе криопротектора при 18-20oС расфасовывают в упаковку из 1-4 эластичных полимерных контейнеров вместимостью 300 или 500 мл до заполнения на 10-33,3% и контейнера-спутника, после чего упаковку помещают в морозильную камеру с предварительно охлажденным хладагентом - раствором этилового спирта. В зависимости от количества суспензии в контейнере и биологических особенностей на первом этапе упаковку, заполненную на 10-20%, помещают в раствор этилового спирта 38-40 об.%, охлажденный до -22Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-25oС, и выдерживают в нем 23-25 мин, упаковку, заполненную на 25-33,3%, помещают в раствор этилового спирта 42-45 об.%, охлажденный до -26Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-30oС, и выдерживают в нем 25-30 мин. При этом объем упаковки составляет 10% объема хладагента в морозильной камере. После завершения холодовой адаптации клеток на втором этапе упаковку помещают в морозильник и замораживают до -40Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-80oС.

Как показывают исследования термограмм, в течение 2-4-й мин первого этапа происходит охлаждение клеток до -2Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-9oС, которые реагируют выбросом тепла на 4-5-й мин. В последующее время идет процесс кристаллизации и переохлаждения клеток консервируемой открытой биологической системы. Охлажденные через 22-24 мин до -22Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-25oС или через 25-30 мин до -26Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-30oС, клетки переходят в фазу холодовой термодинамической стабилизации, после чего (во время второго этапа) происходит окончательное замораживание клеток до - 40Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-80oС, Продолжительность второго этапа составляет 30-60 мин. Замороженные клеточные суспензии пригодны к использованию до 2,5 лет (срок наблюдения). Предлагаемый способ обеспечивает прогнозируемые показатели сохранности жизнеспособности клеток после замораживания-оттаивания на 80-93% и экономию до 2450 мл этилового спирта 96 об.% высокой очистки на каждой операции криоконсервирования клеточных суспензий.

При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа консервирования клеточных суспензий.

Использование простых приемов и доступного оборудования подтверждает промышленную применимость.

Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.

Способ осуществляют следующим образом.

Суспензию клеток в растворе криопротектора при 18-20oС расфасовывают по 50, 75 или 100 мл в полимерные контейнеры "Гемакон" 300, "Гемакон" 500 или "Компопласт" 300 вместимостью, соответственно, 300 или 500 мл, до заполнения на 10-33,3%. Упаковку из 1-4 таких контейнеров и контейнера-спутника помещают на 23-30 мин в морозильную камеру с предварительно охлажденным до -22Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-30oС раствором этилового спирта 38-45 об.%. При этом объем упаковки составляет 10% объема хладагента в морозильной камере. Охлажденную до -22Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-30oС и выдержанную при температуре холодовой адаптации упаковку с замороженной клеточной суспензией затем помещают в морозильник с температурой -40Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-80oС, которую они достигают за 30-60 мин.

Замороженную суспензию клеток при данных условиях хранят от нескольких суток до 2,5 лет.

Размораживание клеток производят путем погружения упаковки в водяную баню и покачивания в ручном или автоматическом режиме при температуре 38-42oС до согревания суспензии клеток до 2-4oС (костный мозг, лейкоциты) и 37oС (тромбоциты).

Показатели сохранности морфологических и функциональных свойств замороженных-оттаянных клеток по различным методам оценки свидетельствуют о высокой эффективности предлагаемого способа консервирования клеток при умеренно низких температурах: - количество жизнеспособных миелокариоцитов, лейкоцитов и тромбоцитов по различным методам оценки составляет 77-91%; - экономия этилового спирта (в пересчете на 96 об.% высокой очистки) на каждой операции составляет 550-2030 мл.

В качестве подтверждения осуществимости способа проведены следующие исследования.

Пример 1. Был взят объем замораживаемой ОБС - суспензии донорских тромбоцитов на растворе криопротектора 60 мл. В эластичный контейнер "Гемакон" 500 (освобожденный от гемоконсерванта) ввели 50 мл суспензии, в результате чего объем контейнера заполнили на 10%, и 10 мл суспензии ввели в контейнер-спутник, контейнеры герметизировали, затем маркировали, вложили в пакет, при этом объем упаковки составил 91 мл. При исходной температуре 18-20oС после 15-20 мин выдержки при комнатной температуре упаковку поместили в морозильную камеру, заполненную 910 мл раствора этилового спирта 38-40 об. %, охлажденного до температуры холодовой адаптации -22Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-25oС, при этом объем упаковки составил 10% объема хладагента. Через 3-4 мин температура суспензии достигала -3,2oС, после 23-25 мин выдержки ОБС охладилась до -24Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-25oС. Эти показатели были стабильными.

На втором этапе упаковку перенесли в морозильник-биохранилище с температурой -40-80oС.

Через 20 суток хранения провели размораживание взвеси в спутнике, затем в полимерном контейнере в водяной бане при 37-38oС в течение 25-30 с для исследования качества замороженной-оттаянной ОБС: - количество тромбоцитов составило 87%; - адгезия тромбоцитов к стеклу - от 12 до 25%; - агрегация тромбоцитов (с АДФ) - 25,3%; - экономия расхода раствора этилового спирта (в пересчете на 96 об.% высокой очистки) за проведенную операцию, в сравнении с традиционной технологией, составила 550 мл.

Пример 2. 85 мл суспензии лейкоцитов донорской крови на растворе криопротектора расфасовали в эластичный контейнер "Компопласт" 300 75 мл до заполнения на 25% и 10 мл - в контейнер-спутник, контейнеры герметизировали, затем маркировали согласно паспортных данных консервируемого биопродукта, вложили в пакет, при этом объем упаковки составил 108 мл. При исходной температуре 18-20oС после 15-20 мин выдержки при комнатной температуре упаковку поместили в морозильную камеру, заполненную 1080 мл раствора этилового спирта 45 об. %, охлажденного до температуры холодовой адаптации -26Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-30oС. Через 3-4 мин температура суспензии достигала -2,9oС, после 25-30 мин выдержки ОБС охладилась до -26Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-28oС. Эти показатели были устойчиво стабильными.

На втором этапе в течение 10 с упаковку перенесли в морозильник-биохранилище с температурой -60-80oС.

Через 48 суток хранения провели размораживание взвеси в спутнике, затем в полимерных контейнерах в водяной бане при 38oС в течение 30 с для исследования качества замороженной-оттаянной ОБС: - количество лейкоцитов составило 89%; - жизнеспособность лейкоцитов 74%; - фагоцитарная активность нейтрофилов 45%; - экономия расхода раствора этилового спирта (в пересчете на 96 об.%) за проведенную операцию, в сравнении с традиционной технологией, составила 573,7 мл.

Пример 3. 310 мл суспензии костномозговых клеток на растворе криопротектора расфасовали в три эластичных контейнера "Гемакон" 300 по 100 мл в каждый до заполнения на 33,3% и 10 мл суспензии - в контейнер-спутник, контейнеры герметизировали, затем маркировали согласно паспортных данных консервируемого биопродукта, вложили в пакет, при этом объем упаковки составил 391 мл. При исходной температуре 18-20oС после 15-20 мин выдержки при комнатной температуре упаковку поместили в морозильную камеру, заполненную 3910 мл раствора этилового спирта 42 об.%, охлажденного до температуры холодовой адаптации -26Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-30oС. Через 3-4 мин температура суспензии достигала -3,2oС, после 25-30 мин выдержки ОБС охладилась до -26Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-28oС. Эти показатели были устойчиво стабильными.

На втором этапе в течение 10 с упаковку перенесли в морозильник-биохранилище с температурой -40Способ криоконсервирования клеточных суспензий, патент № 2195111-80oС.

Через 120 суток хранения провели размораживание взвеси в спутнике, затем в полимерных контейнерах в водяной бане при 39-42oС в течение 30 с для исследования качества замороженной-оттаянной ОБС: - количество жизнеспособных миелокариоцитов составило 93%; - количество коммитированных клеток-предшественников грануломоноцитопоэза составило 64,8%; - экономия расхода раствора этилового спирта (в пересчете на 96 об.% высокой очистки) за проведенную операцию, в сравнении с традиционной технологией, составила 2030 мл.

Предлагаемый способ обеспечивает прогнозируемые показатели сохранности жизнеспособности клеток после замораживания-оттаивания на 80-93%, экономию 550-2030 мл этилового спирта (в пересчете на 96 об.% высокой очистки) на каждой операции, а также снижение профвредности технологии криоконсервирования клеточных суспензий.

Использование в предлагаемом способе стандартных порций фасуемых консервируемых суспензий клеток в стандартные эластичные контейнеры, отношения объема замораживаемых упаковок с ОБС к объему хладагента, равным 10, и снижение об.% рабочего раствора этилового спирта (по отношению к этиловому спирту 96 об.% высокой степени очистки), в зависимости от температуры холодовой адаптации, позволяет значительно упростить криоконсервирование различных ОБС, прогнозировать высокий процент сохранных клеток, снизить затратность технологии и ее профвредность.

Предлагаемая технология криоконсервирования клеток костного мозга и компонентов крови в установленных стандартах технологии предельно проста в реализации, дает стабильный положительный результат, экономию материальных средств и снижение профвредности и найдет широкое применение в медицинской практике.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ консервирования клеточных суспензий путем смешивания с криозащитным раствором в эластичной упаковке, поэтапного замораживания с выдерживанием упаковок в морозильной камере, в хладоагенте в виде раствора этилового спирта, с фиксированной температурой холодовой адаптации и с последующим перемещением для замораживания в хранилище, отличающийся тем, что упаковку, заполненную на 10-20%, помещают в раствор этилового спирта 38-40 об. % с температурой холодовой адаптации от -22 до -25oС, упаковку, заполненную на 25-30%, помещают в раствор этилового спирта 42-45 об. % с температурой холодовой адаптации от -26 до -30oС с последующим замораживанием в хранилище при температуре от -40 до -80oС.



Популярные патенты:

2054235 Лесопосадочная машина

... двуплечий рычаг с захватом, полый сошник и шарнирно закрепленный на раме гидроцилиндр поворота поводка, на двуплечем рычаге захватно-высаживающего механизма шарнирно закреплено водило, взаимодействующее при движении с почвой и снабженное шарнирно закрепленной рамкой с подпружиненным захватом, связанным гибкой тягой с полым сошником; двуплечий рычаг захватно-высаживающего механизма снабжен роликами, взаимодействующими с криволинейными направляющими, жестко закрепленными на раме; полый сошник жестко закреплен на нижнем конце двуплечего рычага захватно-высаживающего механизма. Предложенная совокупность признаков позволит создать лесопосадочную машину, обеспечивающую залесение ...


2048055 Устройство для отрезания и погрузки сенажа и силоса

... движений. Штыри 11, преодолевая усилия сжатия пружин 22, смещают пальцы 19 в отверстиях 16. Пальцы 19 перемещаются в отверстиях 16 до совмещения углублений 20 на пальцах 19 с фиксаторами 21 на рукояти 13 и на другой части 15 ножа. Часть 15 ножа и рукоять 13 устанавливают в одной плоскости. Затем нож с помощью гидроцилиндра 4 поворота и телескопических рычагов 5 и 6 отводится от кронштейна 10 до выхода штырей 11 из отверстий 16 на всю их длину. Включается гидромотор привода ножа и весь рабочий цикл повторяется. Отличие в том, что нож прорезает слои корма рабочей частью 15, а часть 14 ножа в расфиксированном состоянии копирует траекторию движения части 15. Предлагаемое устройство ...


2271092 Сортировка барабанного типа

... с большим количеством налипшей почвы целесообразно увеличивать степень поровисания ячеистой поверхности, что способствует увеличению трения корнеклубнеплодов друг о друга внутри секции и тем самым очищению их от почвы. При сортировании, например, яблок провисание необходимо выполнять минимальным, что снижает повреждения их при взаимных контактах. Для регулирования степени провисания ячеистой поверхности в данной сортировке барабанного типа предусмотрено натяжное средство, выполненное, например, в виде натянутого шнура 2, а также используются поверхности с различной шириной. Спиральный каркас может быть выполнен как цилиндрическим, так и коническим (фиг.1 и 2), при этом ...


2075933 Композиция для иммунизации растений от различных фитопатогенов

... устранить мучнистую росу. Одновременно с этим она оказала положительное влияние на вегетирующие и генеративные органы растений: облиственность увеличилась более чем на 20% количество плодов на 50% Композиция обладает высокой нематицидной, вирусоцидной и бактерицидной активностью при внесении ее в почву, обработке семян и опрыскивании растений во время вегетации. В частности, при использовании композиции на томатах биологическая активность против вируса-стрика составляла почти 100% и бактериозов (черная бактериальная пятнистость) более 50% Обработка композицией семян томатов сорта Карлсон, а также почвы привело к снижению заражения томатов галловыми нематодами до уровня 36,3% при ...


2021671 Машина для уборки льна-долгунца

... кинематической связи (трос 31 + блоки 33 и 34) происходит перемещение рамки 27 с устройством 3 и рамки 16 с выпрямляющим конвейером 13 и при горизонтальном расположении шкивов основного конвейера 12 в прямоточной машине. Так как устройство 3 для отделения семенной части урожая от стеблей и выпрямляющий конвейер 13 передвигаются одновременно в противоположные стороны по длине стеблей на одинаковую величину, не требуется при копировании ленты смещать центр подбирающего барабана относительно середины ширины ленты, т. е. при таком перемещении указанных рабочих органов тракторист ведет подбирающий барабан 9 по ленте и при увеличенной длине стеблей в ней всегда одинаково - так, чтобы ...


Еще из этого раздела:

2076594 Установка для промышленного разведения дождевых червей

2420060 Способ генетической трансформации растений селекционно-ценных образцов клевера лугового

2181640 Способ биологической рекультивации нарушенных земель

2472336 Соломорезка и оснащенная такой соломорезкой уборочная машина

2197796 Рабочий орган ручного почвообрабатывающего орудия

2159721 Способ и устройство для крепления двигателя мотокультиватора

2141182 Культиватор

2305931 Способ регенерации растений клевера лугового при генетической трансформации

2241327 Многоопорная дождевальная машина

2391812 Способ выращивания растений в условиях защищенного грунта, устройство для выращивания растений в условиях защищенного грунта и сборно-разборный многоярусный стеллаж для выращивания растений в условиях защищенного грунта