Препарат для борьбы с хлопковой совкой

Изобретение относится к биотехнологии. Препарат содержит следующие компоненты, мас.%: сухой концентрат штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» VB-06 (с титром не менее 2×1010 полиэдров/г) - 0,3-0,5, альгинат натрия - 0,4-0,6, бычий альбумин - 0,1-0,2, аскорбиновая кислота - 0,07-0,09, хлорид кальция - 0,3-0,5, вода - остальное. Для получения препарата (в виде водной суспензии) сухой концентрат штамма ХС-17 растворяют в воде до нужной концентрации с добавлением стабилизирующих компонентов и прилипателя. Титр жидкой формы препарата составляет не менее 5×109 полиэдров/мл. Расход препарата при наземно-очаговой обработке составляет 40 мл/га. Препарат безвреден для насекомых и позвоночных, обладает повышенной стабильностью при хранении, эффективно и специфически действует на личинки хлопковой совки. 3 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, а именно к производству биологических инсектицидов для сельского хозяйства на основе нового штамма вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), патогенного для личинок хлопковой совки (ХС), являющихся опасным вредителем хлопчатника и многих других культурных растений.

В биологических инсектицидах используются вирусы, вызывающие естественные эпизоотии в популяциях насекомых (Биологические средства защиты растений, М., 1974, 335-345), в том числе бакуловирусы. Палочковидные вирусы (бакуловирусы) представляют большую группу вирусов, инфицирующих только членистоногих насекомых (Miller L.K. (1981), в Genetic Engineering in the Plant Sciences, N. Panopoulous, (ed.) Praeger Publ. New York, pp.203-224; Carstens. (1980) Trends in Biochemical Science 52 107-110; Harrap Payne (1979) в Advances in Virus Research, v.25, Lawfer et al. (eds.) Academic Press N.Y. p.273-355). Многие бакуловирусы инфицируют насекомых, являющихся вредителями промышленно важных сельскохозяйственных и лесных культур. Такие бакуловирусы потенциально представляют собой ценные агенты биологического контроля. Одним из преимуществ бакуловирусов как биологических пестицидов является их специфичность по отношению к насекомому-хозяину. Бакуловирусы как группа инфицируют только членистоногих, а каждый индивидуальный штамм палочковидного вируса обычно инфицирует только один или несколько видов насекомых. Таким образом, они не представляют угрозы ни для окружающей среды, ни для человека и могут быть использованы без вреда для полезных видов насекомых.

Группа бакуловирусов включает подгруппы вирусов ядерного полиэдроза (ВЯП), вирусов гранулеза (ВГ) и палочковидных вирусов, не образующих тела включения. У окклюдирующих форм палочковидных вирусов вирионы (заключенные в оболочку нуклеокапсиды) помещаются внутри кристаллической белковой матрицы. Такая структура, так называемое тело включения или тело "вкрапления" - это форма нахождения вируса в природе вне организма, которая обуславливает передачу инфекции от организма к организму. Отличительной чертой ВЯП является то, что в каждом теле включения может содержаться много вирионов. Тела включения ВЯП обладают относительно большими размерами (до 5 мкм). Тела включения ВГ мельче и содержат по одному вириону. У обеих форм кристаллическая белковая матрица тел включения состоит главным образом из одного полипептида от 25000 до 33000 дальтон, называемого полиэдрином или соответственно, гранулином. Палочковидные вирусы неокклюдирующих форм не производят белок полиэдрин или гранулин и не образуют тел включения.

Применение биологических инсектицидов является экологически оправдано. В отличие от химических средств защиты, например ВЯП ХС, вызывает заболевание и гибель только личинок хлопковой совки, не оказывая вредного воздействия на другие виды животных (насекомых и позвоночных). Кроме того, стоимость получения вируса в пересчете на обрабатываемую площадь оказывается сравнимой со стоимостью используемых в настоящее время химических пестицидов.

Известен инсектицидный препарат на основе штамма ВЯП НШ-2-85, ГКВ N 2156, патогенного для личинок непарного шелкопряда (Патент РФ 2117701, кл. C12N 7/00, оп. 20.08.1998). Для получения препарата партию гусениц непарного шелкопряда по достижении ими четвертой возрастной стадии инфицируют ВЯП (штамм НШ-2-85) и скармливают зараженный корм гусеницам ШП. Затем личинки собирают, лиофилизируют и переносят в аппарат для удаления волосков, являющихся сильным аллергеном. Лишенные волосков лиофилизированные гусеницы размалывают для получения сухого вирусного порошка. В качестве наполнителя используют цеолит или кремниевую кислоту. Препарат в сухой форме представляет собой порошок белого цвета с титром не менее (2-5)×109 полиэдров/г. Титр жидкой формы препарата составляет не менее 1×109 полиэдров/мл. Биологическая активность препарата составляет 4×102 полиэдров/мл. Препарат использовался с титром 5×10 7 полиэдров/г в виде водного 0,1%-ного раствора с ПАВ ОП-7. Расход препарата при наземно-очаговой обработке составляет 1,1-0,3 мл/га. Срок хранения препарата составляет 12 месяцев при температуре 4-6°С.

Недостатком известного препарата является недостаточная биологическая активность препарата, отсутствие значимой вирулентности по отношению к хлопковой совке и низкая стабильность при хранении.

Известен инсектицидный препарат на основе штамма S-13-p ВЯП Porthetria dispar против непарного шелкопряда «Вирин-ЭНШ», полученный путем адаптации ВЯП ивовой волянки к НШ (Итоги и перспективы производства и применения вирусных препаратов в сельском и лесном хозяйстве. Сб., М., 1984, с.3-14). Биологическая активность препарата (ЛД 50), полученного на основе штамма S-13-p, для гусениц Porthetria dispar составляет 4×105 полиэдров на гусеницу. Биологическую активность препаратов на основе штаммов вирусов оценивают путем определения величины LД50 - дозы вируса (полиэдров на гусеницу), вызывающей гибель 50% инфицированных насекомых, и LB50 - время (в сутках), за которое погибает 50% гусениц, инфицированных дозой 107 полиэдров/гусеницу.

Недостатком известного препарата является низкая вирулентность по отношению к непарному шелкопряду Porthetria dispar.

Известен инсектицидный препарат против капустной совки на основе штамма ВЯП Mamestra brassicae (Pd-1-5) ВКПМ virus-1 (АС СССР 1638161, кл. C12N 7/00, оп. 30.03.91) Биологическая активность препарата (ЛД50), полученного на основе штамма Pd-1-5, для гусениц Mamestra brassicae составляет 0,2×105 полиэдров на гусеницу.

Недостатком препарата на основе штамма Pd-1-5 является низкая вирулентность по отношению к капустной совке Mamestra brassicae и отсутствие значимой вирулентности по отношению к хлопковой совке Heliothis armigera Hbn.

Наиболее близким к заявляемому препарату - прототипом, является инсектицидный препарат против капустной совки на основе штамма ВЯП Mamestra brassicae (КС-3-86) ГКВ 2155 (Патент РФ 2153258, кл. A01N 63/00, оп. 27.07.2000). В качестве наполнителя используют цеолит или кремниевую кислоту. Препарат в сухой форме представляет собой порошок белого цвета с титром не менее (2-5)×10 9 полиэдров/г. Для получения жидкой формы препарата (в виде суспензии) перед применением сухой препарат растворяют в воде до нужной концентрации с добавлением поверхностно-активного вещества (ПАВ), например ОП-7. Титр жидкой формы препарата составляет не менее 1×109 полиэдров/мл. Биологическая активность препарата (ЛД50), полученного на основе штамма КС-3-86 для гусениц Mamestra brassicae, составляет (2,3-7,0)×10 4 полиэдров на гусеницу. Расход препарата при наземно-очаговой обработке составляет 1,1-0,3 мл/га. Срок хранения препарата составляет 12 месяцев при температуре 4-6°С.

Недостатком препарата на основе штамма КС-3-86 является недостаточная вирулентность по отношению к капустной совке Mamestra brassicae, отсутствие значимой вирулентности по отношению к хлопковой совке и низкая стабильность при хранении.

Технической задачей предлагаемого изобретения является создание нового инсектицидного препарата, обладающего большей эффективностью и стабильностью при хранении.

Поставленная задача достигается новым вирусным инсектицидным препаратом, содержащим штамм вируса ядерного полиэдроза ХС-17 (авторское название), стабилизирующие добавки и наполнитель.

Штамм ХС-17 выделен в результате селекции вируса, выделенного из гусениц, собранных на полях хлопчатника Таджикистана и погибших от спонтанного полиэдроза в лаборатории, задепонирован в НИИ «Коллекция культур микроорганизмов» ГНЦ ВБ "Вектор" (НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор») под регистрационным номером VB-06.

Препарат для борьбы с хлопковой совкой содержит следующие компоненты, мас.%:

Для получения препарата (в виде водной суспензии) сухой концентрат штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» VB-06 растворяют в воде до нужной концентрации с добавлением стабилизирующих компонентов. Препарат используют с титром не менее 5×109 полиэдров/мл в виде водного 0,02% раствора с прилипателем. В качестве прилипателя преимущественно используют глицерин, или прилипатель «ИЗ», или натрий карбоксиметилцеллюлозу (Na-КМЦ) в стандартных концентрациях. Расход препарата при наземно-очаговой обработке составляет 40 мл/га.

Препарат хранят от 0 до +15° в сухой форме в виде порошка от светло-серого до светло-коричневого цвета. Гарантированный срок хранения препарата при температуре +15°С составляет не менее 18 месяцев. Стабилизирующие компоненты быстро разлагаются почвенной микрофлорой и являются абсолютно безопасными для окружающей среды. Биологическая активность препарата (ЛД 50) составляет (1-2)×102 полиэдров/г, а биологическая эффективность (процент смертности гусениц) лежит в интервале 88-96%.

Стандартные условия культивирования штамма: гусеницы хлопковой совки содержатся при температуре 28°С и влажности 60% на искусственной питательной среде (ИПС) следующего состава: мука люцерновая 88 г, мука кукурузная 35 г, дрожжи кормовые 44 г, кислота аскорбиновая 4,4 г, бензойная кислота 2,0 г, агар 15 мл, вода дистиллированная - до 1000 мл.

Физико-химические свойства: размеры полиэдров (мкм): 1-3, размеры вирионов (нм): 400x80, нуклеокапсидов 310х50 нм. Тип включения вирионов - одиночный. ДНК кольцевая ковалентно-замкнутая, мол.вес 121,4 МД.

Рестрикционный анализ ДНК вируса: сайты рестрикции (количество) для PstI - 7, BamHI - 9, Slal - 7.

Белковый состав вируса: 27 полипептидов. М.вес основных: от 64 до 18 МД.

Круг хозяев: хлопковая совка.

Патогенность для человека: непатогенен.

Определяющими отличиями предлагаемого препарата по сравнению с препаратом - прототипом являются:

- в качестве действующего вещества используют сухой концентрат штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» VB-06 с титром не менее 2×1010 полиэдров/г, что позволяет повысить биологическую эффективность препарата до 88-96%;

- в качестве стабилизирующих добавок используют оптимально подобранный комплекс компонентов, обеспечивающий стабильность препарата при хранении за счет ингибирования радикальных и иных негативных процессов в препарате, вызывающих деактивацию действующего вещества.

В частности, альгинат натрия обеспечивает вязкость препарата и защиту от солнечного облучения; бычий альбумин и хлорид кальция несут буферную функцию, поддерживая постоянное рН препарата; аскорбиновая кислота, обладающая антиоксидантным действием, позволяет ингибировать свободнорадикальные процессы в препарате. В результате удается сохранить активность действующего вещества на уровне 88-96% в течение не менее 18 месяцев.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Технология получения действующего вещества (сухого концентрата штамма) вирусного инсектицидного препарата

Технология производства вирусных препаратов осуществляется по следующей схеме: выращивание насекомых, культивирование в них вирусов, сбор погибших гусениц, выделение вирусной биомассы и получение готового продукта.

Партию гусениц хлопковой совки (ХС) по достижении ими третьей возрастной стадии инфицируют вирусом ядерного полиэдроза. Для этого искусственную питательную среду (корм) опрыскивают вирусной суспензией штамма с титром 2×105 полиэдров/мл и скармливают зараженный корм гусеницам ХС. Гусениц ХС содержат при 27±1,5°С и влажности 65%. Время инкубирования инфицированных гусениц 8-10 дней. При этом гибель насекомых составляет не менее 75%. Затем личинки собирают с помощью вакуумного насоса с давлением (8,7±0,1)×10 4 Па в посуду из толстостенного стекла, добавляют раствор диэтилтиокарбоната натрия до конечной концентрации 0,1% и хранят при температуре от минус 5 до минус 10°С не более года. Для очистки вируса к биомассе из погибших гусениц добавляют дистиллированную воду и размельчают с помощью гомогенизатора. Полученный гомогенат фильтруют через два слоя капроновой ткани с ячейками 0,1 мм, затем фильтрат осаждают центрифугированием. Осадок высушивают на лиофильной установке. Действующее вещество в сухой форме представляет собой порошок белого цвета с титром не менее 2×1010 полиэдров/г. Для получения препарата в емкость необходимого объема вносят действующее вещество, добавляют небольшое количество воды, перемешивают, добавляют стабилизирующие компоненты и доводят объем водой до 100%. Титр живых вирусов составляет не менее 5×10 9 полиэдров/мл.

Пример 2. Исследование токсичности и патогенности заявляемого вирусного препарата

Проведена инфекционно-токсикологическая оценка препарата на основе штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» VB-06 (рабочее название Вирин ХС-17), содержащего следующие компоненты, мас.%:

Испытания безопасности для теплокровных выполнены в соответствии с "Методическими указаниями по оценке новых пестицидов. МЗ СССР, 1988 г." и рекомендациями ВОЗ/ФАО, Женева, 1975 г. по испытанию безопасности бакуловирусов,

Проведены эксперименты по выявлению токсичности-патогенности препарата на мышах. Пяти группам мышей (массой 18-20 г) по 10 в каждой вводили суспензию препарата в желудок и в брюшину из расчета по 1 мг препарата на 1 г веса. Контрольной группе вводили раствор 0,9% NaCl по 0,2 мл.

Введение дозы 1000 мг препарата на 1 кг веса не приводит к гибели животных при введении в желудок. При внутрибрюшинном введении ЛД50 составляет 1000 мг/кг веса. При вскрытии погибших животных выявлены наличие уплотненного воспалительно-некротического очага, а также мелкие комковатые скопления введенного материала в брюшной полости (нерастворимые частицы наполнителя), у 20% животных отмечена увеличенная селезенка, как следствие реакции на выведение кремнийсодержащих материалов. При этом термометрия, взвешивание, гематологические исследования живых мышей не выявили существенных отклонений от физиологической нормы. Серологические исследования, проведенные иммуноферментным и иммунофлуоресцентным методом, не выявили специфического бакуловирусного антигена ВЯП ХС в крови и органах животных на 28-й день обследования.

Кожно-резорбтивное действие изучалось на гвинейских свинках при разовом и многократном нанесении заявляемого препарата на неповрежденную и скарифицированную кожу. Контрольным группам наносили 0,9% NaCl.

Было установлено, что во всех случаях однократное нанесение не вызывало заметных местных или общих реакций у животных. Также не выявлено отклонений от показателей в опытных группах при термометрии или взвешивании животных в течение 14 дней. Многократное нанесение на скарифицированную кожу сопровождалось местной реакцией раздражения, которое проходило через 4-5 дня после окончания воздействия.

Изучение раздражающего действия препарата на слизистую глаз кроликов показало, что однократное воздействие не вызывает раздражение слизистых, а многократное приводило к развитию конъюнктивитов. Выздоровление наступало через 5-7 дней после последнего воздействия. Повреждений роговицы и повышения температуры не отмечено.

Инфекционная оценка препарата проведена на теплокровных. Исследования проводили на культуре клеток эмбриональной ткани человека (ЧЭТ). Культуры инфицировали вирионами ВЯП штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» VB-06 по 0,02 мл на пробирку с титром 1/512 по ИФА. Было проведено 7 пассажей патогенов. С помощью ИФА и ИФ-метода выявляли возможную адаптацию или репродукцию вируса. Установлено, что инфицирование ЧЭТ вирионами ВЯП штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» VB-06 не приводит к цитопатическим изменениям монослоя клеток. В процессе пассажей исходного материала специфический антиген в культурах не выявлялся.

Проводили инфицирование лабораторных животных различного возраста при разных способах введения (в желудок, в нос, в брюшину, в вену, под кожу) суспензией заявляемого препарата. С помощью специально разработанных тест-систем определяли динамику антигенов в крови и внутренних органах испытуемых животных методами ИФА и РИФ. В результате проведенных исследований установлено, что вирусный антиген в крови и во внутренних органах теплокровных животных не накапливается и обычно элиминируется из организма к 7-14 дню после введения. Во всех случаях визуальные наблюдения и термометрия не выявили отклонений от физиологической нормы.

Таким образом, результаты исследования токсичности-патогенности заявляемого вирусного препарата показали, что препарат можно отнести к малотоксичным веществам (четвертая группа по гигиенической классификации). ЛД50 при введении в желудок лежит за пределами 2500 мг/кг, при внутрибрюшинном - за пределами 1000 мг/кг. Действующее вещество препарата на основе штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» VB-06 не токсично для теплокровных, не репродуцируется в теплокровном организме, не вызывает инфекционного процесса.

Пример 3. Сравнительные данные биологической активности заявляемого препарата (Вирин-ХС-17) и препаратов-аналогов

Для получения сравнительных данных параллельно из разных партий гусениц, инфицированных разными штаммами вирусов, получают вирусный материал на основе известных препаратов на основе штаммов Pd-1-5, КС-3-86 и заявляемого препарата.

Биологическую активность известных и заявляемого препарата оценивали путем определения величины ЛД50 - дозы препарата (полиэдров на гусеницу), вызывающей гибель 50% инфицированных насекомых, и ЛВ50 время (в сутках), за которое погибает 50% гусениц, инфицированных дозой 107 полиэдров/гусеницу (пэ/гус). Расчет проводили по методу Кербера, гибель насекомых определяли с поправкой по формуле Аббота (Ашмарин И.П., Воробьев А.А. // Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962, с.82-93). Данные приведены в табл.1.

Анализ табл.1 показывает, что заявляемый препарат патогенен для гусениц ХС, причем по своей активности превышает инсектициды, полученные на основе известных штаммов Pd-1-5, КС-3-86.

Пример 4. Испытание заявляемого препарата в полевых условиях.

Испытания проведены в фермерском хозяйстве Дилфуза-Хасанбай-Зухрахол Чартакского района Наманганской области в объеме крупноделяночного опыта согласно «Методическим указаниям по испытанию инсектицидов, акарицидов, моллюскоцидов в растениеводстве. Москва, 1986» и «Методическим указаниям по испытанию инсектицидов, акарицидов, биологически активных веществ и фунгицидов. Ташкент, 2004». Посев хлопчатника сорт С-65-24 произведен 10 апреля 2007 г. Высота стояния 85-90 см. Густота - 8-9 растений в 1 погонном метре.

Испытывали препарат, содержащий следующие компоненты, мас.%:

Перед применением к препарату добавляли разработанный в институте зоологии АН РУз «прилипатель ИЗ» в количестве 20 г на 200 л воды. Препарат использовали с титром 5×109 полиэдров/мл в виде водного 0,02%-ного раствора. Всего обработана территория площадью 1 га. Расход препарата составил 40 мл/га. Обработка проводилась при помощи ручного опрыскивателя К-90 и тракторного опрыскивателя ОВХ-28.

В процессе испытаний установлено: гибель насекомых наступала через 7-10 суток после обработки. При обследовании гусениц ХС через 7 суток обнаружено, что процент их гибели составляет 75%, через 10 суток 92%, а при последующем обследовании через 15 суток 96%.

Биологическая эффективность заявляемого препарата составила 92-96%.

Пример 5

Испытания препарата Вирин-ХС-17 проводили на посевах хлопчатника фермерского хозяйства Дилфуза-Хасанбай-Зухрахон в Чартакском районе Наманганской области республики Узбекистан в объеме мелкоделяночного опыта. Критерий положительной оценки биологической эффективности препарата для борьбы с хлопковой совкой 85,0%.

Испытывали препарат, содержащий следующие компоненты, мас.%:

Препарат использовали с титром 2×1010 полиэдров/г в виде водного 0,02%-ного раствора. В качестве прилипателя использовали глицерин или натрий карбоксиметилцеллюлозу (Na-КМЦ) в стандартных концентрациях. Воду для разведения препарата брали из арычной сети.

Культура. Хлопчатник сорта С-65-24. Посев 10.04.07. К началу учетов (21.07.07) высота стояния растений 85-90 см, густота стояния 8-9 растений на 1 погонный метр. Растения находились в фазе цветения и образования коробочек.

Обработку растений рабочими растворами заявляемого препарата производили дважды с интервалом 5 дней в вечернее время после захода солнца.

При проведении мелкоделяночных экспериментов для обработки растений использовали ранцевый опрыскиватель К-90 (расход рабочей суспензии препарата 5 л на 1 сотку). В качестве контроля использовали необработанный участок, а в качестве эталона - участок (2 га), обработанный химическим препаратом «Регент, 20% к.э.».

Вариант 1 0,1 мл препарата на 5 л воды с прилипателем «ИЗ».

Вариант 2 0,1 мл препарата на 5 л 10% водного р-ра глицерина.

Вариант 3 1,0 мл препарата на 5 л воды с прилипателем «ИЗ».

Вариант 4 1,0 мл препарата на 5 л 10% водного р-ра глицерина.

Эталон Регент, 20% к.э., 0,12 л/га. Норма расхода рабочей жидкости 200 л/га.

Контроль Без обработки.

Учеты численности вредителя на опытных делянках проводили перед первичной обработкой растений препаратами (предварительный учет), затем на второй, пятый (перед повторной обработкой), восьмой, одиннадцатый и пятнадцатый дни после первичной обработки.

Результаты учетов численности хлопковой совки (количество гусениц на 100 растений) представлены в табл.2.

Результаты расчета биологической эффективности испытываемого препарата и эталона (в процентах) приведены в табл.3.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что заявляемый препарат обладает высокой биологической эффективностью, составляющей 93,4-96%. Во всех вариантах удалось добиться снижения численности гусениц хлопковой совки до экономически безопасного уровня, в то время как в контрольных пробах количество гусениц превышало допустимый порог.

Препарат на основе штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» VB-06 удобен для применения в производственных условиях с использованием любых существующих марок мелкодисперсных опрыскивателей, является экологически чистым и обладает избирательным действием к целевому насекомому - хлопковой совке.

Препарат для борьбы с вредителями хлопчатника

Формула изобретения

Препарат для борьбы с хлопковой совкой, включающий действующее вещество на основе штамма вируса ядерного полиэдроза, приемлемые добавки и наполнитель, отличающийся тем, что в качестве действующего вещества он содержит сухой концентрат штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» VB-06, а в качестве добавок содержит альгинат натрия, бычий альбумин, аскорбиновую кислоту и хлорид кальция при следующем соотношении компонентов, мас.%: