Способ получения генетически модифицированных растений картофеля сорта невский с помощью agrobacterium tumefaciensПатент на изобретение №: 2231549 Автор: Стародубцева А.М. (RU), Белоусова М.Б. (RU), Скрябин К.Г. (RU) Патентообладатель: Центр "Биоинженерия" РАН (RU), Стародубцева Анастасия Михайловна (RU), Белоусова Мария Борисовна (RU), Скрябин Константин Георгиевич (RU) Дата публикации: 27 Ноября, 2003 Начало действия патента: 24 Апреля, 2002 Адрес для переписки: 121165, Москва, Г-165, а/я 15, ООО"ППФ-ЮСТИС", пат.пов. А.Е.Груниной, рег. № 0401 Изображения  Изобретение относится к селекции растений. Экспланты растений картофеля сорта Невский сокультивируют с трансформированным штаммом A. tumefaciens, а затем помещают на питательную среду для инициации каллусообразования с последующей регенерацией из них фертильных трансгенных растений. Сокультивирование осуществляют контактированием эксплантов через бумажный фильтр с поверхностью агаризованной среды, на которую нанесен бактериальный штамм, в течение 48  4 ч. Для инициации каллусообразования экспланты помещают на питательную среду, содержащую зеатин в количестве 0,5-3,5 мг/л и НУК - 0,01-0,05 мг/л. На восьмой день экспланты помещают на среду для регенерации, содержащую зеатин в количестве 0,5-3,5 мг/л и ГК3 - 0,01-0,05 мг/л. В результате увеличивается выход трансформированных растений. 4 з.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл.
Изобретение относится к селекции и биотехнологии растений, в частности генной инженерии. Изобретение может быть использовано для получения генетически модифицированных растений картофеля сорта Невский, экспрессирующего различные гетерологичные гены.Способ получения трансгенных растений картофеля сорта Невский заключается в генетической трансформации сегментов стебля (эксплантов) in vitro культивируемых растений картофеля методом сокультивирования с Agrobacterium tumefaciens, несущей рекомбинантные плазмиды с селективными, маркерными и полезными генами, и в последующей регенерации до фертильных трансгенных растений, имеющих внесенные гены и сохраняющих все признаки исходного сорта.Картофель (Solanum tuberosum var. tuberosum) выращивается в России повсеместно, практически во всех климатических зонах. Относительно высокая продуктивность при известной простоте возделывания позволяет картофелю стабильно занимать второе место после злаковых культур в отечественном сельскохозяйственном производстве. Сегодня более 90% товарного картофеля производится в личных подсобных хозяйствах (ЛПХ), а для наименее обеспеченных слоев населения картофель находится на первом месте в рационе питания.Таким образом, проблема получения стабильного урожая картофеля является одной из важнейших. В России решение этой проблемы осложняется рядом неблагоприятных факторов, среди которых основное место занимают потери урожая от болезней, вредителей и сорной растительности.Первые работы по трансформации картофеля были начаты в восьмидесятых годах XX века [Ooms G, Hooykaas PJJ, van Veen RJM, van Bellen P, Regensburg-Tuink TJG, Schilperoort RA. Plasmid 1985 7: 15-29], и в 1986 году впервые была показана возможность получения картофеля с использованием Agrobacterium tumefaciens [An G., Watson B.D., Chiang C.C. Plant Physiology, 1986, v.81, p.301-305], сотрудниками Центра “Биоинженерия” РАН в 1990-1992 г.г. [Глагоцкая Т.Ц., Шульга О.А., Сидоров В.А., Захарьев В.М., Скрябин К.Г., Глеба Ю.Ю. ДАН СССР 314, №5, с.1240-1242, 1990, Feher A., Skryabin K.G., Balazs E., Preiszner J., Shulga O.A., Zakharyev V.M., Dudits D. Plant Cell Reports, 1992, v.11, p.48-52].За первыми попытками последовало более 200 работ, многие из которых посвящены модификации и оптимизации процедуры трансформации [Tavazza R., Tavazza М., Ordas R.J., Ancora G., Benvenuto E. Plant Science, 1988, v.59, p. 175-181; Snyder G.W. & Belknap W.R. Plant Cell Reports, 1993, v.12, p.324-327]. Миновав первый этап разработки и освоения методов трансформации, к настоящему моменту во многих странах перешли к этапу внедрения полученных результатов в производство, что, в свою очередь, обусловило переход от работы с модельными, легко трансформируемыми генотипами к коммерческим генотипам (сортам). Однако подавляющее большинство коммерческих сортов картофеля, включая и основные российские сорта, не относится к легкотрансформируемым.Несмотря на усилия по созданию единой эффективной методики трансформации, такая система трансформации для различных генотипов (сортов) до сих пор не создана. При необходимости получения модифицированных растений трудно трансформируемых коммерческих сортов приходится проводить оптимизацию протокола для каждого генотипа [Wordragen M.F. & Dons H.J.M. Plant Molecular biology reporter, 1992, v.10(1), p.12-36].Наиболее близким к предложенному является способ получения генетически модифицированных растений картофеля [Гулина И.В. Создание трансгенных растений картофеля, экпрессирующих модифицированный ген  -эндотоксина из В. thuringiensis var tenebrionis. Диссертация, М., 1994, с.9, б-ка Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта].Этот способ получения генетически модифицированных растений картофеля осуществляется следующим образом (модификация известного метода Horsch R.B., Rogers S.G., Fraley R.T. Transgenic plants. Cold Spring Harb Symp Quant Biol., 1985; 50:433-7).Стеблевые сегменты картофеля получали из растений, выращенных асептически в течение четырех недель на среде S1, и переносили их в жидкую среду MS. Ночную культуру штамма Agrobacterium tumefaciens добавляли к стеблевым сегментам, находящимся в чашке Петри в 10 мл жидкой среды MS таким образом, чтобы соотношение культуры штамма Agrobacterium и среды инкубирования составляло 1:20. Сокультивирование штамма Agrobacterium и стеблевых сегментов растений картофеля проводили в течение 16-18 ч при 28 С в темноте. По окончании инкубации сегменты переносили на среду MS, содержащую агар в концентрации 0,7%. Через трое суток сегменты переносили на среду MSV с фитогормонами состава: 0,2 мг/л НУК, 1 мг/л зеатина, 0,02 мг/л ГК3, 1 мг/л БАП, соли MS, 0,7% агар, 100 мкг/мл цефотаксима, 200 мкг/мл карбенициллина, 50 мкг/мл канамицина. Регенеранты переносили на среду S1, содержащую селективный агент и цефотаксим, чтобы предупредить агробактериальное заражение растений.Данная методика не является эффективной для картофеля сорта Луговской.В ближайшем аналоге раскрыта методика получения трансгенного картофеля на примере другого сорта. По мнению авторов заявки и большинства специалистов в данной области процессы регенерации и трансформации растений являются генотипзависимыми, то есть эффективность и возможность получения положительного результата во многом определяются самим генотипом (в данном случае - сортом).Из этого следует, что для достижения высокой эффективности необходимо заново подобрать все условия (параметры) регенерации - трансформации для каждого конкретного сорта (генотипа).Авторы использовали методику для сорта Чародей и получили низкую эффективность регенерации и трансформации (эти цифры приведены ниже).Задачей изобретения является создание эффективной методики трансформации растений картофеля сорта Невский.Технический результат изобретения заключается в повышении эффективности трансформации данного генотипа.Развитие биотехнологии привело к переходу от фундаментальных работ к решению практических задач сельского хозяйства, фармацевтики, медицины. Для решения таких задач возникает проблема не просто получения трансгенного растения, а получения достаточного (по разным оценкам от сотен до нескольких тысяч) количества первичных трансгенных растений - индивидуальных трансформационных событий, среди общего пула которых возможно будет выбрать удовлетворяющие всем требованиям селекционеров - оригинаторов (трансгенное растение не должно отличаться от исходного по сортовым характеристикам), требованиям биобезопасности (стабильности введенной вставки в геноме в поколениях и т.д.), требованиям пищевой безопасности (генетически модифицированное не должно отличаться от исходного растения по пищевым и токсикологическим характеристикам). Таким образом, чем большее количество первичных трансгенных растений будет получено, тем быстрее и эффективнее будет решена конкретная задача.Эффективность трансформации, понимаемая как отношение количества первичных трансгенных растений (для которых подтверждено наличие вставки в геноме) к общему количеству полученных регенерантов, напрямую зависит от эффективности регенерации, которая определяется как отношение количества полученных регенерантов (среди них могут быть как трансгенные, так и “пустые” нетрансгенные растения) к количеству эксплантов (то есть к количеству затраченного исходного материала). Оба показателя обычно представляют в процентах.Технический результат достигается тем, что в способе получения генетически модифицированных растений картофеля, заключающемся в сокультивировании эксплантов со штаммом Agrobacterium tumefaciens, несущим рекомбинантные плазмиды с селективными маркерными и полезными генами, помещении эксплантов на питательную среду для инициации каллусообразования и последующей регенерации до фертильных трансгенных растений, имеющих внесенные гены и признаки исходного сорта, сокультивацию эксплантов картофеля сорта Луговской предпочтительно осуществлять путем раскладывания эксплантов на влажном бумажном фильтре, смоченном разведенной суспензией штамма Agrobacterium, и выдержки в течение 484 ч при 18-221С, для инициации каллусообразования используют питательную среду, содержащую зеатин в количестве 0,2-1,0 мг/л, БАП в количестве 0,2-1,0 мг/л и НУК в количестве 0,01-0,05 мг/л, а на среду для регенерации, содержащую зеатин в количестве 0,2-1,0 мг/л, БАП в количестве 0,2-1,0 мг/л и ГК3 в количестве 0,01-0,05 мг/л, экспланты переносят на восьмой день.Для подготовки штамма Agrobacterium целесообразно его предварительно засевать штрихом на питательную среду на 30,5 сут в темноте при 24-29С, за двое суток до сокультивации засевать полученной смесью колоний первую ночную культуру штамма Agrobacterium в питательной среде, за одни сутки до сокультивации засевать вторую ночную культуру путем внесения в питательную среду первой ночной культуры, в день сокультивации концентрируют ночную культуру, то есть осаждают и разводят осадок в жидкой среде.Кроме того, после сокультивации отмывку эксплантов можно осуществлять путем помещения эксплантов в раствор, содержащий жидкую среду и антибиотик, подавляющий развитие штамма Agrobacterium, на 5-40 мин при комнатной температуре.В другом более предпочтительном варианте после помещения эксплантов в раствор отмывку можно проводить с использованием ротационной качалки.Перечень графических материаловНа фиг.1 приведена карта плазмиды pBIBar.На фиг.2 приведен пример электрофоретического анализа продуктов ПЦР на препаратах ДНК модифицированных линий сорта Луговской (негатив). Дорожки:1, 24 - маркер молекулярной массы GeneRuler Fermentas, 100 bp;3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 - ПЦР на препаратах ДНК растений, в которых обнаружен перенесенный ген thau II;22 - ПЦР на препарате ДНК растений исходного нетрансформированного сорта Чародей;2, 23 - продукт ПЦР на плазмидной ДНК (0,1 нг/реакцию), использованной для трансформации растений.Способ получения генетически модифицированных растений картофеля сорта Луговской осуществляют следующим образом.Данный протокол рассчитан на постановку одного трансформационного эксперимента, исходя из среднего количества исходных материнских растений - 10010 шт. Среднее количество эксплантов - 50050 шт.Культура исходных растений: исходные растения, свободные от вирусной и вироидной инфекции, культивировали в асептических условиях в культуре in vitro. Для этого стебли исходных растений нарезали на черенки с одной пазушной почкой и культивировали в вегетационных сосудах на питательной среде, содержащей минеральные соли и витамины (например, среда Msbase, табл.1) при температуре +18-221С в дневное и +15-181С в ночное время; фотопериодичности 16 ч день/8 ч ночь (освещенность 120  E) 3-5 недель.Подготовку штамма Agrobacterium проводили следующим образом.Засевали штамм Agrobacterium tumefaciens штрихом на питательную среду (например, среда LB, табл. 4), на 30,5 сут в темноте, при +25-281С. За два дня до планируемой трансформации засевали смесью колоний первую (I) ночную культуру штамма Agrobacterium объемом 1-6 мл - 0,2 в питательной, среде (например, среда LB, табл.4) при +25-281С, 100-14010 об/мин.За день до сокультивации засевали вторую (II) ночную культуру объемом 5-103 мл. Для этого вносили в питательную среду (например, среда LB, табл.4) ночную культуру I в количестве 1/100 от конечного объема. Культивировали при +25-281С, 100-14010 об/мин.Первый день трансформацииКонцентрировали ночную культуру II, осадив при 3,5-50,5 тыс. об/мин в течение 3-101 мин. Разводили полученный осадок в 3-101 мл жидкой среды (например, среда СМ, табл.1).Нарезали стебель на сегменты без пазушных почек длиной 5-102 мм.1. Сокультивация:В чашки Петри помещали стерильные бумажные фильтры, равномерно смачивали их небольшим количеством разведенной суспензии штамма Agrobacterium (1-30,5 мл), экспланты раскладывали на влажном фильтре для сокультивации на 484 ч при 18-211С. В контрольном варианте использовали вместо суспензии штамма Agrobacterium такое же количество жидкой питательной среды (например, среда СМ, табл.1).2. Отмывка эксплантов:Вариант I. Помещали экспланты в раствор (15-5010 мл), содержащий жидкую среду (например, среда Msbase, табл.1) и раствор4. Отмывка эксплантов:Вариант I. Помещали экспланты в раствор (15-5010 мл), содержащий жидкую среду (например, среда Msbase, табл.1) и раствор антибиотика, подавляющего развитие штамма Agrobacterium, на 10-305 мин при комнатной температуре (18-211С).Вариант II. Экспланты в растворе жидкой среды и антибиотика, приготовленном как в варианте I, отмыли с использованием ротационной качалки (шейкера) при 50-7010 об/мин в течение 15-3010 мин при комнатной температуре (18-211C).Третий день трансформацииПосле сокультивации (включая этап отмывки, когда она необходима) помещали экспланты на питательную среду (например, среда CIM, табл.1) для инициации каллусообразования.Использовали в питательной среде для инициации каллусообразования: зеатин в концентрации от 1,0 до 3,00,5 мг/л и НУК в концентрации от 0,02 до 0,040,01 мг/л.Восьмой деньПеренесли экспланты на чашки со средой для регенерации (например, среда RM, табл.1), с добавлением селективного агента, выбранного в зависимости от используемой генетической конструкции.Для тестирования эффективности процесса регенерации в контрольных вариантах использовали среду для регенерации без добавления селективного агента (например, среда RM, табл.1).Использовали в питательной среде для регенерации: зеатин в концентрации от 1,0 до 3,00,5 мг/л и ГК3 в концентрации от 0,02 до 0,040,01 мг/л.Через каждые 14 днейПереносили экспланты на свежие чашки Петри со средой для регенерации того же состава.При появлении регенерантовСрезали регенеранты и перенесли их в пробирки, содержащие среду для укоренения (например, среда RIM, табл.1).Первичные регенеранты, укоренившиеся на селективной среде, считались прошедшими первичный отбор.Далее прошедшие отбор первичные регенеранты проверяли на наличие перенесенной генетической конструкции при помощи ПЦР-анализа с праймерами, специфичными для кодирующей области трансгенной конструкции. Уровень экспрессии целевого гена проверяли при помощи иммуноферментного анализа [Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, v.76(9):4350-4].Эффективность регенерации по предложенному способу для сорта Невский составляет 74,4% по сравнению с 58,9% для способа по ближайшему аналогу.Эффективность трансформации по предложенному способу для сорта Невский составляет 14,8% по сравнению с 9,7% для способа по ближайшему аналогу.Экспериментальный пример использования патентуемого способа получения трансгенных растений картофеля сорта НевскийЭксперимент по получению трансгенных растений картофеля сорта Невский, экспрессирующих ген bar, обеспечивающий устойчивость растений к гербицидам на основе фосфинотрицина.Культура исходных растений: исходные растения, свободные от вирусной и вироидной инфекции, в количестве 90 шт. культивировали в асептических условиях в культуре in vitro. Для этого стебли исходных растений нарезали на черенки с одной пазушной почкой и культивировали в вегетационных сосудах на питательной среде, содержащей минеральные соли и витамины (среда Msbase, табл.1) при температуре +18-211С в дневное и +15-181С в ночное время; фотопериодичности 16 ч день/8 ч ночь (освещенность 120 Е) 3-5 недель.Для трансформации использовали штамм Agrobacterium tumefaciens СВЕ 121, содержащий плазмиду pBIBar (фиг.1), в состав кассеты экспрессии которой входят генетические конструкции:промотор pNOS - ген NPT II - NOS-T терминатор 35S промотор-ген bar - NOS Т' терминатор.Подготовку штамма A tumefaciens СВЕ 121 проводили следующим образом. Засевали штамм A. tumefaciens СВЕ 121 штрихом на питательную среду LB (табл.4), содержащую селективные антибиотики рифампицин и канамицин в концентрации 25 и 50 мг/л соответственно, на 30,5 сут в темноте, при +261С.За два дня до планируемой трансформации засевали смесью колоний первую (I) ночную культуру штамма A. tumefaciens СВЕ 121 объемом 6 мл 0,2 в питательной среде LB (табл.4), содержащей селективные антибиотики рифампицин и канамицин в концентрации 25 и 50 мг/л соответственно, при +261С, 100-14010 об/мин.За день до сокультивации засевали вторую (II) ночную культуру объемом 61 мл. Для этого вносили в питательную среду LB (табл.4), содержащую селективные антибиотики рифампицин и канамицин в концентрации 25 и 50 мг/л соответственно, ночную культуру I в количестве 1/100 от конечного объема. Культивировали при +261С, 100-14010 об/мин.Первый день трансформацииСконцентрировали ночную культуру II, осадив при 3,50,5 тыс. об/мин в течение 31 мин. Развели полученный осадок в 51 мл жидкой среды (среда СМ, табл.1). Нарезали стебель на сегменты без пазушных почек длиной 5-102 мм. Для проведения этапа сокультивации в чашки Петри помещали стерильные бумажные фильтры, равномерно смачивали их небольшим количеством разведенной суспензии штамма A. tumefaciens СВЕ 121 (20,5 мл), экспланты раскладывали на влажном фильтре для сокультивации на 484 ч при +18-211С.В контрольном варианте вместо суспензии штамма A. tumefaciens СВЕ 121 использовали такое же количество жидкой питательной среды (среда СМ, табл.1).После проведения этапа сокультивации отмывали экспланты по следующей схеме:помещали экспланты в раствор (15-5010 мл), содержащий жидкую среду (среда СМ, табл.1) и раствор антибиотика карбенициллина (500 мг/л), подавляющего развитие штамма A. tumefaciens СВЕ 121, отмывали с использованием ротационной качалки (шейкера) при 50-7010 об/мин в течение 15-3010 мин при комнатной температуре (18-20С).Третий день трансформацииПосле сокультивации (включая этап отмывки) помещали экспланты на питательную среду (среда CIM, табл.1) для инициации каллусообразования.Использовали в питательной среде для инициации каллусообразования: зеатин в концентрации от 0,5001 мг/л и НУК в концентрации 0,020,001 мг/л.Восьмой деньПереносили экспланты на чашки со средой RM для регенерации (среда RM, табл.1) с добавлением селективного агента фосфинотрицина в концентрации 10 мг/л. В качестве селективного агента использовали фосфинотрицин, так как генетическая конструкция содержит ген bar, кодирующий фермент фосфинотрицил ацетил трансферазу (ФАТ), экспрессия которого обеспечивает устойчивость к фосфинотрицину.Для тестирования эффективности процесса регенерации в контрольных вариантах использовали среду для регенерации без добавления селективного агента (среда RM, табл.1).Использовали в питательной среде для регенерации: зеатин в концентрации 0,50,01 мг/л и ГК3 в концентрации от 0,020,001 мг/л.Через каждые 14 днейПереносили экспланты на свежие чашки Петри со средой для регенерации того же состава.При появлении регенерантовСрезали регенеранты и переносили их в пробирки, содержащие среду для укоренения (среда RIM, табл. 1).Первичные регенеранты, укоренившиеся на селективной среде, содержащей фосфинотрицин в концентрации 10 мг/л, считали прошедшими первичный отбор.Далее прошедшие отбор первичные регенеранты проверяли на наличие перенесенной генетической конструкции при помощи ПЦР-анализа с праймерами, специфичными для кодирующей области трансгенной конструкции. Для ПЦР-анализа генома растений на наличие гена bar использовали праймерную систему, описанную Падегимасом Л. [Падегимас Л. и др., 1993]. Оба праймера находятся на расстоянии 558 нуклеотидов друг от друга.BarF primer: 5'- GGG ATC CAT GAG CCC AGA ACG ACG - 3'24 bpBarR primer: 5' - GGA GCT СТА GAT CTC GGT GAG G - 3'22 bpМетодика проведения ПЦР - анализаПроведение ПЦР осуществляли на ДНК-амплификаторе Techne Genius. Центрифугирование осуществляли на настольной микроцентрифуге Eppendorf 5415C, с максимальной скоростью вращения ротора 14000 об/мин. Термостатирование образцов осуществляли в сухом термостате “Термо 28-23”. Анализ продуктов ПЦР производили путем электрофореза в агарозном геле соответствующей концентрации при напряженности электрического поля 6 В/см с последующим окрашиванием гелей бромистым этидием (концентрация красящего раствора 1 мкг/мл в воде, время окрашивания - 20 мин при комнатной температуре) и фотографированием полученной картины в ультрафиолете (длина волны - 260-280 нм) на фотопленку “Микрат-Изопан” при помощи TTL-фотоаппарата типа "Зенит" (светофильтр КС-8). Ввод полученных данных электрофореза в компьютер осуществляли посредством прямого сканирования негативов на сканере Mustek 9600. Обработку оцифрованной информации проводили при помощи пакета Adobe Photoshop 5.0.Состав реакционной смеси для ПЦР:Праймеры - по 25 пМ каждого;10 буфер - 2,5 мкл;2 мМ dNTP - 2,5 мкл;BioTaq полимераза 5Е мкл - 0,5 мкл;ДНК-матрица - 100 нг;Н2О - до 25 мкл.Условия проведения ПЦР были выбраны следующие: 43 цикла: 94С - 5 с, 55С - 5 с, 72С - 20 с, окончательная полимеризация - 7 мин.Появление продукта ПЦР с указанными праймерами и длиной 558 нуклеотидов при условии отсутствия его в реакциях, поставленных на контрольной ДНК, свидетельствует о присутствии искомого гена в геномной ДНК анализируемой линии.Результаты эксперимента по получению трансгенных растений картофеля сорта Невский, экспрессирующих ген barВ результате проведения одного трансформационного эксперимента (по описанному выше протоколу) было получено 378 регенерантов из 508 эксплантов от 90 исходных растений. Таким образом, эффективность регенерации (процентное отношение количества регенерантов к количеству эксплантов) составила 74,4%.Последующий после получения регенерантов и первичного отбора на селективной среде первичный молекулярный анализ методом ПЦР (фиг.2) подтвердил наличие перенесенного ген bar в геноме 56 растения (пример - картинка), следовательно, эффективность трансформации (процентное отношение трансформантов к количеству регенерантов) составила 14,8%.В период с 10 июня 2000 по 20 сентября 2000 г. на сертифицированном МВК ГИД участке ВНИИ Фитопатологии РАСХН, пос. Б. Вяземы, Московская обл. были проведены ограниченные полевые испытания полученных трансгенных линий картофеля сорта Невский, экспрессирующих ген bar. Испытания проводили с целью подтвердить проявление внесенного признака в полевых условиях и отобрать жизнеспособные, фенотипически нормальные растения. После обработки в два срока суммарной дозой гербицида фосфинотрицина 6 л/га (3+3) трансгенные растения не проявляли признаков фитотоксического угнетения. Обработанные гербицидом контрольные (нетрансформированные) растения погибли полностью.В конце вегетационного сезона был получен первичный семенной материал. Анализ отобранных линий по урожайности не выявил существенных различий между модифицированными и контрольными линиями, вероятность существенности различий составила 62% для линий сорта Невский (статистическую обработку полученных данных проводили при помощи пакета программ Statistica 5.5).Наименования и происхождение препаратов приведено в табл.5.  Для приготовления сред, представленных в табл.1, готовили раствор MS-солей в деионизованной воде, доводя рН до значения 5,6-5,80,1 с помощью растворов 1N КОН и 1N HCl. Стерилизацию сред осуществляли в автоклаве при 1 атм, 121С в течение 20 мин. После охлаждения среды до +45-50С добавляли витамины (табл.2), гормоны, антибиотики и селективные агенты (методика приготовления и концентрации стоков см. табл.3) соответственно составу сред и заливали чашки Петри ( 9 см) по 205 мл среды в каждую.   ** - стерилизовать фильтрованием с помощью мембранных фильтров (Millipore, диаметр пор 0,22 мкм); *** - стоки антибиотиков хранятся 1 месяц при 4С; при -20С большинство антибиотиков сохраняют стабильность в течение нескольких месяцев.    Список сокращенийCb - карбенициллин;Cf - цефотаксим;Km - канамицин;LB - питательная среда Luria-Bertani;Rf - рифампицин;БАП (ВАР) - 6-бензиламинопурин;ГК3 (GA3) - гиббереллиновая кислота;ИМК (IBA) - индолил-3 -масляная кислота;НУК (NAA) - нафтилуксусная кислота;ПНР - полимеразная цепная реакция;среда Msbase - среда базовая, на основе смеси солей;среда СМ - среда для со-культивации - co-cultivation media;среда CIM - среда для инициации каллусообразования - callus induction media;среда RM - среда для регенерации - regeneration media;среда RIM - среда для корнеобразования - root induction media;л - литр;мл - миллилитр;мкл - микролитр;мкг/мл - микрограмм в миллилитре;мг/л - миллиграмм в литре;л/га - литров на гектар;мМ - миллимоль вещества;пМ - пикомоль вещества;нг - нанограмм;В/см - вольт на см;шт. - штук;об/мин - оборотов в минуту;нм - нанометр;мкм - микрометр;см - сантиметр;мм - миллиметр;сек - секунда;мин - минута;С - градусы по Цельсию;атм - атмосфера;МВК ГИД - Межведомственная комиссия по генно-инженерной деятельности;РАСХН - Российская Академия Сельскохозяйственных наук;И.т.с. - индивидуальное трансформационное событие;DMTR - дезоксирибонуклеотиды;MQ - установка Milli Q для деионизирования воды;рН - водородный показатель;N - нормальность;pNOS - промотор;NPT II - ген, кодирующий белок неомицинфосфотрансферазу;NOST - терминатор;35S - промотор;pBIBar - плазмида;Bar - ген белка;LBA 4404 - штамм Agrobacterium tumefaciens.
Формула изобретения1. Способ получения генетически модифицированных растений картофеля, заключающийся в сокультивировании эксплантов со штаммом Agrobacterium tumefaciens, несущим рекомбинантные плазмиды с селективными, маркерными и полезными генами, помещении эксплантов на питательную среду для инициации каллусообразования и последующей регенерации до фертильных трансгенных растений, имеющих внесенные гены и признаки исходного сорта, отличающийся тем, что для инициации каллусообразования эксплантов картофеля сорта Невский используют питательную среду, содержащую зеатин в количестве 0,5-3,5 мг/л и НУК в количестве 0,01-0,05 мг/л, а на восьмой день помещают экспланты на среду для регенерации, содержащую зеатин в количестве 0,5-3,5 мг/л и ГК3 в количестве 0,01-0,05 мг/л.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сокультивацию осуществляют путем нанесения суспензии штамма Agrobacterium tumefaciens на поверхность агаризованной питательной среды, накрывания его бумажным фильтром, раскладывания на фильтре эксплантов с последующей выдержкой в течение (48В±4) ч при (18-21)С1С.3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что для подготовки штамма Agrobacterium tumefaciens его предварительно засевают штрихом на питательную среду на (30,5) суток в темноте при 24-29С, за двое суток до сокультивации засевают полученной смесью колоний первую ночную культуру штамма Agrobacterium tumefaciens в питательной среде, за одни сутки до сокультивации засевают вторую ночную культуру путем внесения в питательную среду первой ночной культуры, в день сокультивации концентрируют ночную культуру, осаждают и разводят осадок в жидкой среде.4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что после сокультивации помещают экспланты в раствор, содержащий жидкую среду и антибиотик, подавляющий развитие штамма Agrobacterium tumefaciens, на 5-40 мин при комнатной температуре для отмывки эксплантов.5. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что помещают экспланты в раствор, содержащий жидкую среду и антибиотик, подавляющий развитие штамма Agrobacterium tumefaciens, и отмывают экспланты при комнатной температуре с использованием ротационной качалки в течение 5-40 мин.
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе Дата прекращения действия патента: 25.04.2005 Извещение опубликовано: 20.07.2006 БИ: 20/2006 NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение Извещение опубликовано: 27.08.2006 БИ: 24/2006 Популярные патенты: 2271096 Способ прогнозирования урожайности озимых зерновых культур в условиях засушливого климата ... влияние температурного режима на формирование корневой системы растений, кг·сутки/°С·м 2;k3=(7...150) - коэффициент пропорциональности, учитывающий размещение растений на поверхности поля, кг/м; Gs - гидротермический коэффициент Г.Т.Селянинова. MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе Дата прекращения действия патента: 03.08.2006 Извещение опубликовано: 10.04.2008 БИ: ... 2243658 Способ повышения урожайности картофеля и томатов ... обработка растений регулятором ускоряет и стимулирует развитие и функционирование фотосинтетического аппарата, стимулирует синтез ассимилятов, формирование и функциональную активность фотосинтетического аппарата. Вторая обработка усиливает функционирование фотосинтетического аппарата, активирует синтез ассимилятов, улучшает их отток из листьев и поступление в запасающие органы, у надземных хозяйственно ценных органов ускоряет и стимулирует их рост, развитие и функционирование, отложение питательных веществ в запас в них. Третья обработка активирует рост заканчивающих рост надземных запасающих органов, задерживает старение растений, и тем самым продлевает период активного накопления ... 2086081 Рабочий орган культиватора ... стойки 1, при наличии двух профилей 2 они меняются местами на стойке 1. Тот же эффект будет достигнут, если стойку 1 развернуть на 180o относительно рамы культиватора при сохранении положения профилей 2 на стойке. Во всех вариантах в работу вступает противолежащее лезвие 6 или 7. Таким образом, изобретение позволяет рассширить функциональные возможности рабочего органа за счет установки на стойке одного или двух [-образных профилей и за счет наличия различных вылетов (ширины захвата) A1 или A2. Повышение износостойкости почти в 4 раза достигается путем переустановки на стойке [-образного профиля на 180o как в вертикальной, так и в горизонтальной плоскости, вследствие чего в ... 2455825 Пестицидная аэрозольная композиция ... органическом растворителе предпочтительно составляет, например, от примерно 70 до примерно 100% по массе.Содержание органических растворителей в пестицидной аэрозольной композиции согласно настоящему изобретению обычно составляет от 10 до 79% по массе, предпочтительно от 20 до 70% по массе.Пропеллент, включенный в пестицидную аэрозольную композицию согласно настоящему изобретению, представляет собой сжиженный газ с температурой кипения от -50°С до 0°С, примеры пропеллентов включают сжиженный нефтяной газ (liquefied petroleum gas - LPG), диметиловый эфир, пропан, н-бутан и изобутан. Содержание пропеллента в пестицидной аэрозольной композиции согласно настоящему изобретению ... 2403705 Способ автоматического управления температурно-световым режимом в теплице ... ... |
Еще из этого раздела: 2120752 Способ консервирования ксеногенных клеток печени 2265444 Способ консервирования пантов 2115638 Способ переработки органических отходов животного происхождения в кормовой белок и биогумус 2060650 Дозатор концентрированных кормов 2485762 Ракета для активного воздействия на облака 2189736 Способ отбора гибридов кукурузы, устойчивых к засухе и стеблевым гнилям 2488263 Система механической подачи недомолота для вторичного обмолота на возвратную доску 2050099 Косилка с всасывающим устройством 2167510 Способ и устройство для изготовления круглых тюков соломы или подобного материала с пленочным защитным покрытием 2498561 Способ тандемного возделывания сельскохозяйственных культур для повышения производства пищевых зерновых культур |
Изобретения в сельском хозяйстве
Обработка почвы в сельском и лесном хозяйствах
Посадка, посев, удобрение
Уборка урожая, жатва
Обработка и хранение продуктов полеводства и садоводства
Садоводство, разведение овощей, цветов, риса, фруктов, винограда, лесное хозяйство
Новые виды растений или способы их выращивания
Производство молочных продуктов
Животноводство, разведение и содержание птицы, рыбы, насекомых, рыбоводство, рыболовство
Поимка, отлов или отпугивание животных
Консервирование туш животных, или растений или их частей
Биоцидная, репеллентная, аттрактантная или регулирующая рост растений активность химических соединений или препаратов
Хлебопекарные печи, машины и прочее оборудование для хлебопечения
Машины или оборудование для приготовления или обработки теста
Обработка муки или теста для выпечки, способы выпечки, мучные изделия
|
|
||