Способ консервирования ксеногенных клеток печениПатент на изобретение №: 2120752 Автор: Гладских Л.В. Патентообладатель: Гладских Лариса Валентиновна Дата публикации: 27 Октября, 1998 Изображения Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к выделению и сохранности культуры клеток. Способ заключается в следующем: отбирают печень от клинически здоровых свиней в возрасте 2 - 5 месяцев, разделяют на доли, проводят перфузию солевым раствором Хенкса, освобождают от глиссоновой капсулы, печень механически разрушают, фильтруют. Полученный осадок промывают солевым раствором, обогащают питательной средой 119 на растворе Хенкса, замораживают и сушат на поддонах сублимационной сушкой. Способ позволяет повысить жизнеспособность и активность ксеногенных клеток печени при удешевлении способа, а также возможность для перорального применения в клинической практике и для производства лекарственных форм. 2 з.п.ф-лы, 1 табл. Изобретение относится к биотехнологии, а именно к выделению и сохранности культуры клеток. Создание биологических препаратов на основе функционально активных клеток является одним из самых сложных направлений биотехнологии. Стабильность биологических свойств изолированных клеток, например таких, как функциональная активность, предъявляют особые требования к биотехнологии промышленного производства препаратов и определяют их эффективность. Отсутствие заметных успехов в культивировании гепатоцитов на искусственных питательных средах привело к созданию способа выделения изолированных гепатоцитов из донорской печени, а также разработке путей и методов для возможно более длительного поддержания их функциональной активности с целью использования их при лечении синдрома печеночной недостаточности различной этиологии. Применение клеточной терапии требует наличия действующего банка гепатоцитов с сохранением их функциональной активности. Известный способ консервирования выделенных клеток печени в жидком азоте при минус 196oС предъявляет особые требования к наличию соответствующего оборудования, больших производственных площадей, требует больших энергетических затрат. Данный способ не предусматривает транспортирование выделенных клеток для клинического использования в другие медицинские заведения, в связи с непродолжительным сроком их сохранности и функциональной активности вне дюара с жидким азотом. (Онищенко Н.А. 1994, Суббота Н.П., 1992). Известен также способ консервирования интактных клеток печени, где предусмотрена ферментативная обработка донорского органа, расфасовка полученных клеток в стеклянные ампулы объемом 2 см3 со средой 199 и замораживанием при минус 50 o С в течение 3-4 ч под вакуумом 50-100 мм рт.ст. с сублимацией при минус 30 - минус 20oС и температурой досушивания 25oС. (Гладских Л.В. и др. Патент N 2073435, 20.02.97). Этот способ позволяет сохранять функциональную активность клеток в течение 12 мес. Однако он требует дорогостоящих ферментных препаратов для выделения клеток, больших объемов растворов Хенкса для их отмывки, имеет лекарственную форму и дозировку, непригодную для перорального применения в клинической практике. Задачей изобретения является повышение жизнеспособности и активности ксеногенных клеток печени при упрощении и удешевлении способа, а также возможность для перорального применения в клинической практике и для производства лекарственных форм. Это достигается тем, что способ включает забор печени, перфузию раствором Хенкса, освобождение от капсулы, диспергирование печени, стабилизацию ее в среде 199, замораживание с последующей сублимационной сушкой. Согласно изобретению, отбирают печень клинически здоровых свиней в возрасте 2-5 мес, проводят разделение ее на доли, проводят перфузию соленым раствором Хенкса, который по своему составу и соотношению ионов соответствует межклеточной жидкости, освобождают от глиссоновой капсулы, печень механически разрушают, фильтруют, полученный осадок промывают солевым раствором, обогащают питательной средой 199 на растворе Хенкса в соотношении 10:1, сушат на поддонах толщиной слоя 40-50 мм. Целесообразно фильтрацию проводить через фильтр 100-120 мкм, затем через фильтр 40-60 мкм, а замораживание осуществлять при температуре минус 30-35oС в течение 3-4 ч, с последующей сублимационной сушкой при температуре минус 25-30oС в течение 36-48 ч и досушиванием при 20-25oС. Для обоснования данного способа были проведены экспериментальные исследования. Для выделения изолированных ксеногенных гепатоцитов используют свиную печень, полученную от клинически здоровых животных. Ксеногенные гепатоциты имеют преимущества по сравнению с аллогенными: доступность биологического материала, уменьшение срока тепловой ишемии донорского органа, исключение инфицирования вирусными гепатитами, ВИЧ-инфекцией. Установлены возрастные пределы для животных-доноров: нижний - два месяца в связи с тем, что дефинитивные отношения в печени окончательно завершаются к этому возрасту, верхний - пять месяцев, так как у животных старше этого возраста по результатам ветеринарно-санитарной экспертизы в 65% выявляются дистрофические изменения в печени. В связи с тем, что масса печени часто превышает 1,1 кг и имеет более развитую соединительно-тканную строму, обладает большей теплоемкостью, проводят ее разделение на доли. Затем раствором Хенкса проводят перфузию до соломенно-желтого цвета печени и удаляют глиссоновую капсулу. Механически разрушают ткань печени до получения гомогенной суспензии, которую фильтруют дважды через фильтры: 100-120 мкм из нержавеющей стали для первой фильтрации и 40-60 мкм из капрона - для второй. Осадок промывают раствором Хенкса и центрифугируют, затем к осадку добавляют питательную среду 199 на растворе Хенкса в соотношении 10:1, разливают на поддон толщиной 50 мм и замораживают при температуре минус 35oС в течение 3-4 ч с последующей сублимационной сушкой при температуре минус 25oС в течение 36-48 ч с температурой досушивания 20-25oС. Полученный препарат после измельчения и просеивания передают на фасовку. Препарат высушенных клеток печени, полученный по данному способу, оценивали по функциональной активности, которая определялась методом К. Бакирджиева, основанным на изменении скорости бродильной реакции дрожжей. При анализе результатов испытаний установили, что активность высушенных клеток выше в четыре раза по сравнению с контрольной пробой, которая сохраняется в течение 18 мес (см. таблицу). Пример 1. Отбирают печень от клинически здорового животного трехмесячного возраста массой 900 г. Отделяют желчный пузырь и разделяют печень на доли. Затем через систему кровеносных сосудов проводят перфузию раствором Хенкса до соломенно-желтого цвета печени. Для уменьшения срока перфузии печень подвергают массированию. Затем удаляют глиссоновую капсулу с помощью металлического гребня и измельчают до получения гомогенной суспензии. Фильтрование проводят через фильтр 100 мкм из нержавеющей стали для первой фильтрации и 60 мкм из капрона - для второй. Осадок промывают раствором Хенкса и центрифугируют, затем к осадку добавляют питательную среду 199 на растворе Хенкса в соотношении 10:1, разливают на поддон толщиной 50 мм и замораживают при температуре минус 35oС в течение 3 ч с последующей сублимационной сушкой при температуре минус 30oС в течение 36 ч с температурой досушивания 20oС. Функциональная активность высушенных клеток составляет 420%. Пример 2. Отбирают печень от клинически здорового животного четырехмесячного возраста массой 1100 г. Отделяют желчный пузырь и разделяют печень на доли. Затем через систему кровеносных сосудов проводят перфузию раствором Хенкса до соломенножелтого цвета печени. Для уменьшения срока перфузии печень подвергают массированию. Затем удаляют глиссоновую капсулу с помощью металлического гребня и измельчают до получения гомогенной суспензии. Фильтрование проводят через фильтр 120 мкм из нержавеющей стали для первой фильтрации и 40 мкм из капрона - для второй. Осадок промывают раствором Хенкса и центрифугируют, затем к осадку добавляют питательную среду 199 на растворе Хенкса в соотношении 10:1, разливают на поддон толщиной 50 мм и замораживают при температуре минус 30oС в течение 4 ч с последующей сублимационной сушкой при температуре минус 25oС в течение 48 ч с температурой досушивания 20oС. Функциональная активность высушенных клеток составляет 400%. Пример 3. Отбирают печень от клинически здорового животного двухмесячного возраста массой 750 г. Отделяют желчный пузырь и разделяют печень на доли. Затем через систему кровеносных сосудов проводят перфузию раствором Хенкса до соломенножелтого цвета печени. Для уменьшения срока перфузии печень подвергают массированию. Затем удаляют глиссоновую капсулу с помощью металлического гребня и измельчают до получения гомогенной суспензии. Фильтрование проводят через фильтр 100 мкм из нержавеющей стали для первой фильтрации и 60 мкм из капрона - для второй. Осадок промывают раствором Хенкса и центрифугируют, затем к осадку добавляют питательную среду 199 на растворе Хенкса в соотношении 10:1, разливают на поддон толщиной 50 мм и замораживают при температуре минус 35oС в течение 3 ч с последующей сублимационной сушкой при температуре минус 25oС в течение 36 ч с температурой досушивания 25oС. Функциональная активность высушенных клеток составляет 410%. Таким образом, как видно из таблицы, предлагаемый способ наиболее экономичен и эффективен по сравнению с прототипом. Формула изобретения1. Способ консервирования ксеногенных клеток печени, включающий забор печени свиней, перфузию раствором Хенкса, освобождение печени от капсулы, диспергирование печени путем механического измельчения, двухстадийной фильтрации, промывки и центрифугирования, стабилизацию ее в среде 199, замораживание с последующей сублимационной сушкой, отличающийся тем, что используют печень 2-5 месячных свиней, перед диспергированием проводят разделение ее на доли, для стабилизации используют дополнительно раствор Хенкса в соотношении со средой 199 1:100, а сушку проводят на поддонах толщиной слоя 40-50 мм. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что первую стадию фильтрации осуществляют через фильтр 100-120 мкм, а вторую стадию - через 60 мкм. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что замораживание осуществляют при температуре минус 30-35oC, а досушивание - при температуре плюс 20oC.QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения Лицензиар(ы): Гладских Лариса Валентиновна Вид лицензии*: НИЛ Лицензиат(ы): Закрытое акционерное общество "Медминипром" Договор № РД0040569 зарегистрирован 08.09.2008 Извещение опубликовано: 20.10.2008 БИ: 29/2008 * ИЛ - исключительная лицензия НИЛ - неисключительная лицензия QZ4A - Регистрация изменений (дополнений) лицензионного договора на использование изобретения Лицензиар(ы): Гладских Лариса Валентиновна Вид лицензии*: НИЛ Лицензиат(ы): Закрытое акционерное общество "Медминипром" Характер внесенных изменений (дополнений): Изменение, не относящееся к сведениям, приведенным в патенте. Дата и номер государственной регистрации договора, в который внесены изменения: 08.09.2008 № РД0040569 Извещение опубликовано: 10.02.2009 БИ: 04/2009 * ИЛ - исключительная лицензия НИЛ - неисключительная лицензия Популярные патенты: 2245017 Способ подготовки картофеля перед закладкой на хранение ... ВНИИБЗР, 2001, с.20-21). Недостатком этого способа является опасность для человека и невозможность использования при обработке продовольственной продукции.Известен способ подготовки растениеводческой продукции, в том числе картофеля, перед закладкой на хранение, предусматривающий его облучение (Метлицкий Л.В., Рогачев В.И., Хрущев В.Г. Радиационная обработка пищевых продуктов. - М.: Экономика, 1967, с.10-95).Этот способ приемлем как для семенного, так и для продовольственного картофеля, но снижает его лежкоспособность из-за нарушения иммунного статуса и активации ферментов, а также приводит к снижению органолептических показателей картофеля продовольственного назначения и к ... 2473211 Приспособление для автоматической дойки молочного скота ... и источник излучения жестко с доильным роботом или компонентом доильного зала для максимальной простоты конструкции.Настоящее изобретение будет теперь описано более подробно со ссылкой на иллюстративные воплощения, изображенные на прилагаемых чертежах, на которых: Фиг.1 изображает схематичный вид в перспективе приспособления с конструкцией роботизированной руки и датчиком в соответствии с изобретением;Фиг.2 изображает вид спереди приспособления, изображенного на Фиг.1;Фиг.3 изображает вид сбоку конца конструкции роботизированной руки с датчиком, закрепленным альтернативным образом;Фиг.4 изображает трехмерный вид датчика, иФиг.5 изображает схематичный вид системы управления ... 2475020 Способ подбора лучших сортов опылителей для насаждений яблони ... веществ в пыльце, причем завязываемость плодов, у всех опыляемых сортов, резко возрастает, если пыльца опылителей содержит водорастворимых веществ более 50% от своей сухой массы. Отсутствие в некоторых случаях строго последовательной зависимости завязывания плодов от содержания водорастворимых веществ в пыльце опылителей объясняется тем, что на завязываемость плодов могут оказывать влияние такие факторы, как, например, разнокачественность пыльцевых зерен и пестиков различных сортов яблони.В целом из данных таблиц 2, 3 и 4 можно заключить, что пыльца лучших сортов опылителей содержит водорастворимых веществ более 50% от своей сухой массы, и чем содержание больше, тем опылительные ... 2080765 Комбайн для уборки овощей ... масляном баке 17. Все транспортеры комбайна выполнены прутковыми и покрыты мягким материалом, как и корпусы всех барабанов, которые имеют регулировки по высоте относительно друг друга, фазы максимального вылета пальцев и частоты вращения. Механизм натяжения полотна горки 6 треугольной формы представлен в виде вала, регулируемого по высоте полотна. При этом возможно изменение межосевого расстояния ведущего и ведомого валов горки 6, что позволяет регулировать силу и величину раскрытия и закрытия свободных частей пальчиков полотна горки. Механизм 8 натяжения полотна горки 6 треугольной формы, имея регулировку по месту натяжения полотна этой горки, обеспечивает получение угла огибания ... 2409937 Растение с высоким содержанием ребаудиозида а ... электрофореза. Используя праймеры, отличные от приведенных выше, сравнивали сорт Morita и сорт SN.Экстракцию ДНК проводили с помощью СТАВ метода. Примерно по 0, 5 г листьев сорта Morita и сорта SN замораживали жидким азотом в ступке, листья размалывали пестиком. Каждый размолотый образец смешивали с 20 мл 2% раствора СТАВ (100 мМ трис-HCl (рН 8,0) 20 мМ, EDTA (рН 8,0), 2% СТАВ, 1,4 М NaCl, 1% PVP) в пробирке Фалкона объемом 50 мл с последующей инкубацией при 65°С в течение 30 мин. Туда добавляли равное количество хлороформа:изоамилового спирта (24:1), с последующим перемешиванием в течение 10 мин, а затем подвергали разделению центрифугированием при 3500 об/мин в ... |
Еще из этого раздела: 2229127 Способ испытания растущих деревьев после рубок прореживания и проходных 2438305 Способ выращивания цыплят-бройлеров 2259028 Устройство для безотвальной обработки почвы 2060618 Пневматический высевающий аппарат 2278509 Брудер для обогрева сельскохозяйственных животных 2195102 Устройство для отделения грунта и земли от корней и корневищ солодки в качестве лакричного сырья 2227965 Способ возделывания бахчевых культур и устройство для его осуществления 2460269 Малогабаритный картофелеуборочный комбайн 2263431 Устройство для предпосевной обработки семян 2149547 Пневматический опрыскиватель |
Изобретения в сельском хозяйстве
Обработка почвы в сельском и лесном хозяйствах
Посадка, посев, удобрение
Уборка урожая, жатва
Обработка и хранение продуктов полеводства и садоводства
Садоводство, разведение овощей, цветов, риса, фруктов, винограда, лесное хозяйство
Новые виды растений или способы их выращивания
Производство молочных продуктов
Животноводство, разведение и содержание птицы, рыбы, насекомых, рыбоводство, рыболовство
Поимка, отлов или отпугивание животных
Консервирование туш животных, или растений или их частей
Биоцидная, репеллентная, аттрактантная или регулирующая рост растений активность химических соединений или препаратов
Хлебопекарные печи, машины и прочее оборудование для хлебопечения
Машины или оборудование для приготовления или обработки теста
Обработка муки или теста для выпечки, способы выпечки, мучные изделия
|
|
||