Способ повышения приживляемости зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией у свиней-реципиентовПатент на изобретение №: 2199290 Автор: Рябых В.П., Ниязов Н.С., Попова Е.А., Маркина Л.И., Трубицина Т.П. Патентообладатель: Рябых Владимир Павлович, Трубицина Татьяна Петровна, Ниязов Нияз Саидалиевич, Попова Елена Алексеевна, Маркина Людмила Ивановна, Государственное научное учреждение Всероссийский научно- исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных Дата публикации: 27 Февраля, 2003 Начало действия патента: 27 Декабря, 2000 Адрес для переписки: 249013, Калужская обл., г. Боровск, Боровский р-н, п. Институт, ВНИИФБиП, гр. патентоведения Изображения Изобретение относится к биологии, в частности к биотехнологии получения трансгенных животных. Трансплантацию зигот, микроинъекцированных генно-инженерной конструкцией, проводят в два яйцевода по 9-12 штук в каждый свиньям-реципиентам, половой цикл которых синхронизирован с половым циклом свиней доноров эмбрионов. Способ позволяет более чем на 20% повысить супоросность у свиней-реципиентов и почти в 2 раза - приживляемость эмбрионов. 1 табл. Изобретение относится к области биологии, в частности к биотехнологии получения трансгенных животных, и может быть применено для повышения эффективности технологии получения трансгенных свиней. Большое внимание к свинье, как объекту для работ по трансгенозу, объясняется тем, что свинья является многоплодным животным, имеющим сравнительно короткий воспроизводительный цикл. От нее можно получать большое число оплодотворенных яйцеклеток, необходимых для введения в них чужеродных генов, и получать от одного реципиента несколько потомков, развившихся из зигот, микроинъецированных этими генами, что является важнейшим условием для успешной работы по трансгенозу. В связи с тем, что свиноводство является одной из ведущих отраслей сельскохозяйственного производства, улучшение генотипа свиней и ускорение селекционного процесса в направлении повышения продуктивности, устойчивости к болезням и улучшения качества продукции с помощью трансгеноза имеет большое народнохозяйственное значение. Кроме того, расчеты показывают, что из-за своей многоплодности и скороплодности свинья может быть удобным объектом для получения трансгенных животных-суперпродуцентов человеческих биологически активных веществ фармакологического назначения. В последние годы интенсивно ведутся исследования, направленные на выяснение возможности трансплантации органов и тканей животных человеку (ксенотрансплантация). Принимая во внимание анатомо-физиологические сходства и соразмерность некоторых органов свиньи (сердце, почки, и др.) с органами человека, а также отсутствие общих с человеком инфекционных заболеваний, исследователи склонны считать, что при определенном генетическом вмешательстве в иммунные процессы органы трансгенных свиней могут быть использованы для ксенотрансплантации их человеку. Таким образом, благодаря многоплодности и скороплодности свинья становится одним из основных объектов технологии трансгеноза. До настоящего времени основным способом введения чужеродных генов в геном животных является метод микроинъекции генно-инженерных конструкций в пронуклеусы зигот, включающий различные микроманипуляции (центрифугирование, прокол цитоплазматической и ядерной оболочек, введение в пронуклеус чужеродной ДНК в буферном растворе и т.д.), действие которых оказывает определенное отрицательное влияние на развитие микроинъецированных зигот и, соответственно, на их приживляемость при трансплантации свиньям-реципиентам. Трансплантация зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией, свиньям-реципиентам является одним из основных этапов технологии получения трансгенных свиней, от которого в значительной степени зависит приживляемость эмбрионов, выход потомства и, следовательно, общая эффективность технологии. Известно два способа трансплантации эмбрионов свиней. Первый способ трансплантации эмбрионов свиньям-реципиентам заключается в том, что эмбрионы поздних стадий развития (морулы и бластоцисты) в количестве 15-18 штук пересаживают в один рог матки хирургическим способом с помощью специальных катетеров. Трансплантация эмбрионов свиней в один рог матки основывается на установленном в 60-х годах факте, свидетельствующем о том, что эмбрионы свиней обладают способностью мигрировать из одного рога матки в другой (Dziuk P.J., Polge С., Rowson L. E. A. - Intra-uterine migration and mixing of embryos in swine following egg transfer.- J. Anim. Sci. 1964, v. 23: 37-42). Это свойство свиных эмбрионов позднее стали использовать при трансплантации эмбрионов предимплантационных стадий развития животным-реципиентам. Общепринято свиньям-реципиентам пересаживать эмбрионы в один рог матки, полагая, что эмбрионы сами равномерно распределятся в рогах матки за счет эффекта миграции. Трансплантация эмбрионов в один рог матки менее трудоемка и требует меньших затрат времени. Супоросность свиней-реципиентов при трансплантации эмбрионов поздних стадий развития в один рог матки составляет 50-60%, а приживляемость эмбрионов 20-25% (Hunter R.H.F., Polge С. and Rowson L.E.A. - The recovery, transfer and survival of blastocysts in pigs. - J. Reprod. Fert. 1966, v. 14: 501-502). Второй способ. Наиболее близким по технологической сущности к предлагаемому изобретению является способ трансплантации зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией (прототип). При этом способе у свиней-доноров вызывают суперовуляцию и производят извлечение из яйцеводов эмбрионов, находящихся на стадии зиготы, затем в пронуклеусы зигот микроинъецируют генно-инженерную конструкцию и после этого микроинъецированные зиготы трансплантируют в один из яйцеводов свиней реципиентов, половой цикл которых синхронизирован с половым циклом свиней доноров эмбрионов с помощью гормональной обработки. В связи с тем, что при данном способе трансплантации эмбрионов животным-реципиентам пересаживают не бластоцисты, а зиготы, в которые введена генно-инженерная конструкция, то их вводят не в матку, а в яйцевод, и в количестве, значительно превышающем число бластоцист, пересаживаемых в рог матки при обычной трансплантации эмбрионов (30-40 против 15-18 соответственно), так как принимается во внимание снижение жизнеспособности у определенной части зигот, которое происходит в процессе манипуляций, связанных с микроинъекцией в них генно-инженерной конструкции. Как и при трансплантации обычных бластоцист, зиготы, микроинъецированные генно-инженерной конструкцией, вводят в один яйцевод свиней-реципиентов полагая, что развивающиеся эмбрионы смогут мигрировать во второй рог матки и равномерно распределиться в рогах матки. Однако супоросность свиней-реципиентов и приживляемость эмбрионов при таком способе пересадки остается очень низкой (30-40% и 5-7% соответственно) (К. Spinsmann, G. Brem - Embryotransfer beim Schwein im Rahmen von Gentransferprosrammen - Tierarztl. Prax. Suppl. 4, 21-25, 1989). В этом исследовании одной группе (I гр.) свиней-реципиентов трансплантировали менее 40 микроинъецированных эмбрионов, а второй группе - более 40. Супоросными стали 25% реципиентов I группы и 46% -II группы. Однако приживляемость эмбрионов была выше у супоросных реципиентов I группы, чем у второй. Результаты наших исследований по выяснению зависимости приживляемости эмбрионов от числа зигот, трансплантированных свиньям-реципиентам, показал, что с увеличением числа трансплантированных эмбрионов с 10 до 40 увеличивалось число супоросных реципиентов с 20 до 43%. Но приживляемость эмбрионов у них при этом снижалась с 33,3% при пересадке 10 эмбрионов до 13,3% при пересадке 31-40 эмбрионов. Аналогичное снижение приживляемости эмбрионов наблюдалось и при пересчете на всех использованных реципиентов с 8,9 до 5,7% при пересадке 11-20 и 31-40 микроинъецированных зигот соответственно. Более низкий процент приживляемости эмбрионов при трансплантации большого числа микроинъецированных зигот (свыше 30) по-видимому обусловлен повышенной смертностью эмбрионов на стадии элонгации, когда на небольшом участке рога матки скапливается большое число элонгированных эмбрионов длиной до 1 метра. И поэтому наиболее высокий процент приживляемости эмбрионов наблюдается при трансплантации не очень большого числа микроинъецированных зигот. В этом случае после гибели определенной части эмбрионов на ранних стадиях развития, вызванной различными манипуляциями, связанными с микроинъекцией в них генно-инженерных конструкций, стадии элонгации достигает меньшее число эмбрионов, для которых сохраняются лучшие условия для имплантации. Целью настоящего изобретения является разработка способа повышения приживляемости зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией, у свиней-реципиентов для повышения общей эффективности технологии получения трансгенных свиней. Поставленная цель достигается тем, что в предлагаемом способе трансплантацию зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией, проводят в два яйцевода по 9-12 штук в каждый свиньям-реципиентам, половой цикл которых синхронизирован с половым циклом свиней доноров эмбрионов. В известном способе трансплантацию микроинъецированных зигот производят в один яйцевод в количестве 30-40 штук. Пример. Для получения большого числа зигот у свиней-доноров вызывали суперовуляцию. Группе свиней, находившихся на 12-15-ом дне полового цикла (считая первый день предыдущей охоты нулевым днем), в один и тот же день дважды с интервалом 8-10 часов подкожно вводили один из препаратов простагландина F2  в дозе, рекомендованной для свиней согласно инструкции. Через 24-36 часов после введения простагландина свиньям однократно внутримышечно вводили один из препаратов сыворотки крови жеребых кобыл (СЖК) в дозе 1200-1500 И. Е. на голову, а через 72-80 часов после введения гонадотропина СЖК животным однократно внутримышечно вводили хорионический гонадотропин человека (ХГ) в дозе 750-1000 И.Е. Через 40-42 часа после введения свиньям ХГ их осеменяли однократно и через 16-18 часов после этого проводили извлечение эмбрионов на стадии зиготы. Для синхронизации половых циклов свиней-реципиентов обрабатывали гормональными препаратами по той же схеме, что и свиней-доноров, за исключением того, что доза СЖК была снижена до 600-700 И.Е. Эмбрионы ранних стадий развития извлекали путем промывания яйцеводов у животных доноров средой Дюльбекко, обогащенной 4% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Морфологическую оценку эмбрионов свиней проводили под инвертированным микроскопом, оснащенным оптикой Номарского, в среде DMEM с HEPES, обогащенной 20% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Для облегчения визуализации пронуклеусов в зиготах и ядер в 2-4-клеточных эмбрионах проводили их центрифугирование при 10.000-13.000g в течение 5-7 минут, обеспечивающее смещение липидных и пигментных включений к одному из полюсов эмбриона. Микроинъекцию генно-инженерных конструкций в пронуклеусы зигот осуществляли стеклянной инъекционной иглой с наружным диаметром кончика 1,5-2 мкм на установке, включающей инвертированный микроскоп типа ICM-405 с оптикой дифференциально-интерференционного контраста (DIC) и комплект манипуляторов и инъекторов. Точность введения раствора экзогенной ДНК определяли по увеличению размера пронуклеусов. Для микроинъекции использовали генно-инженерную конструкцию, включающую нуклеотидные последовательности человеческого гена гранулоцит-колониестимулирующего фактора под промотором гена S1-казеина крупного рогатого скота. Объем чужеродной ДНК, вводимой в пронуклеусы, составлял 1-2 пл с концентрацией 4-6 нг/мкл, что соответствовало 400-600 копиям генно-инженерной конструкции на одну инъекцию. Трансплантацию микроинъецированных эмбрионов свиньям-реципиентам проводили в ампулярную часть яйцевода со стороны бахромки с помощью специального пластикового катетера. Свиньям-реципиентам контрольной группы зиготы в количестве 20-25 штук пересаживали в один яйцевод, а животным опытной группы - в оба яйцевода по 10-12 зигот в каждый яйцевод. Анализ результатов эксперимента (см. таблицу) свидетельствует о том, что процент супоросности был достоверно выше у свиней-реципиентов, которым трансплантировали микроинъецированные зиготы в оба яйцевода, т.е. при двусторонней трансплантации (66,6% против 45,4%), при практически одинаковом количестве зигот, трансплантированных одному реципиенту (22,3 2,2 и 21,32,4). Аналогичная закономерность наблюдалась и по приживляемости эмбрионов, как в пересчете на всех реципиентов (10,1% против 3,4%), так и на одного супоросного реципиента (15,2% против 7,5%, соответственно). Это увеличение процента супоросности и приживляемости эмбрионов у свиней-реципиентов достигается за счет того, что при трансплантации микроинъецированных зигот в два яйцевода происходит более равномерное распределение эмбрионов в рогах матки, что создает для них наиболее благоприятные условия для развития, чем при односторонней пересадке. Таким образом, предлагаемый способ трансплантации зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией, позволяет более чем на 20% повысить супоросность у свиней-реципиентов, в 2 раза - приживляемость эмбрионов и выход потомства, а следовательно, и общую эффективность технологии получения трансгенных свиней.
Формула изобретенияСпособ повышения приживляемости зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией, у свиней-реципиентов, включающий синхронизацию половых циклов свиней-доноров и реципиентов и трансплантацию этих зигот в один из яйцеводов свиней-реципиентов, отличающийся тем, что трансплантацию зигот свиньям-реципиентам проводят в оба яйцевода, причем в каждый яйцевод пересаживают по 9-12 зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией.MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе Дата прекращения действия патента: 28.12.2007 Извещение опубликовано: 27.07.2009 БИ: 21/2009 Популярные патенты: 2492633 Устройство для автоматического полива ... в пространстве, воздушная камера сообщается с верхней частью накопителя воды с помощью трубопровода, в накопителе воды отверстие впускного конца сливного трубопровода расположено ниже отверстия выпускного конца всасывающего трубопровода, внешняя часть всасывающего трубопровода снабжена водовоздушным затвором, представляющим собой отвесный участок, внешняя часть сливного трубопровода снабжена водовоздушным затвором, представляющим собой U-образный прогиб.2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что нижняя часть отвесного участка всасывающего трубопровода размещена ниже нижней части U-образного прогиба сливного трубопровода.3. Устройство по п.1, отличающееся тем, что воздушная ... 2059362 Установка для выращивания мидий ... навстречу потоку воздуха. Создаваемое давление в трубке 24 Пито передается в цилиндрический сосуд 26 в полость под поплавком 27. Полость над поплавком 27 соединяются с атмосферой при помощи трубки 30 и отверстия, расположенного в приемнике. Под действием потока воздуха под поплавком 27 создается повышенное давление, а над поплавком пониженное. В результате чего поплавок всплывает. При помощи стержня 28 происходит взаимодействие с микропереключателем 29. Микропереключатель 29 замыкает электрическую цепь, питающую электрический звонок 31 и реле времени 32. Если на плоту имеются люди, они должны за определенный отрезок времени покинуть плот 1. Через определенный отрезок времени реле ... 2139657 Инсектицидная композиция ... соответствующей 3,6,9, 12, 15 и 18 месяцам хранения при температуре 20oC. В таблице 1 приведена динамика содержания АДВ в инсектицидном препарате при хранении, определяемая методом газожидкостной хроматографии. Из таблицы 1 видно, что действующие вещества в течение 18 месяцев практически не теряют активность. Сравнивая примеры А и Б, можно увидеть, что введение в композицию, состоящую из трех АДВ, таких компонентов, как пиперонилбутоксид и 2,5 фурандион, дигидро-3-(тетрапропенил) - стабилизатор обеспечивает заявляемой композиции за счет обнаруженного нового синергетического эффекта значительное резкое улучшение свойств, а именно повышается инсектицидная активность и увеличивается ... 2234219 Композиция для отпугивания паразитов ... ряда, включающего С1-С3алкил, С1-С3галоалкил, С1-С3галоалкокси, галоген, циано, гидроксил, С1-С3алкокси, амино, СНО или нитро;R2 и R3 независимо друг от друга обозначают водород, С1-С3 алкил,С1-С3галоалкил, С1-С3галоалкокси, галоген, циано, гидроксил, амино, арил или нитро;Ra обозначает водород, незамещенный С1-С20алкил или С1-С20алкил, имеющий один или несколько заместителей, выбранных из ряда, включающего галоген, циано, гидроксил, алкокси, нитро, фенил, бифенил, бензилокси или феноксифенил, где каждая из фенильной, бифенильной, бензилокси или феноксифенильной групп, в свою очередь, является незамещенной или имеет один или несколько заместителей, выбранных из ряда, включающего ... 2181640 Способ биологической рекультивации нарушенных земель ... микроорганизмов, в том числе разрушающих нефть и нефтепродукты (в том числе мазут, гудрон). В комплексе с биопрепаратами используют посев травосмеси и регуляторы роста растений. Способ позволяет осуществить биологическую ремедиацию площадей, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, особенно при загрязнениях тяжелыми фракциями (мазутом, гудроном). 4 з.п. ф-лы, 4 табл. ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Изобретение относится к экологии, биотехнологии, почвоведению, а именно к биологической рекультивации техногенно и антропогенно нарушенных земель, выведенных из хозяйственного оборота зольниками ТЭЦ и ГРЭС, промышленными шламами и отвалами, образовавшимися ... |
Еще из этого раздела: 2384052 Способ повышения эмбриональной жизнеспособности и естественной резистентности цыплят-бройлеров 2054862 Гидравлический режущий аппарат 2175477 Способ борьбы с тлями 2275804 Способ повышения продуктивности птицы 2415570 Искусственное роение и борьба с естественным роением пчелиных семей 2168887 Машина для добычи корней 2161400 Способ определения активности агентов 2130247 Замкнутый пневмосепаратор 2227965 Способ возделывания бахчевых культур и устройство для его осуществления 2098936 Осевой вентилятор |
Изобретения в сельском хозяйстве
Обработка почвы в сельском и лесном хозяйствах
Посадка, посев, удобрение
Уборка урожая, жатва
Обработка и хранение продуктов полеводства и садоводства
Садоводство, разведение овощей, цветов, риса, фруктов, винограда, лесное хозяйство
Новые виды растений или способы их выращивания
Производство молочных продуктов
Животноводство, разведение и содержание птицы, рыбы, насекомых, рыбоводство, рыболовство
Поимка, отлов или отпугивание животных
Консервирование туш животных, или растений или их частей
Биоцидная, репеллентная, аттрактантная или регулирующая рост растений активность химических соединений или препаратов
Хлебопекарные печи, машины и прочее оборудование для хлебопечения
Машины или оборудование для приготовления или обработки теста
Обработка муки или теста для выпечки, способы выпечки, мучные изделия
|
|
||