Способ размножения стромальных клеток тестикул (семенников), мужских половых зародышевых клеток, сперматогоний, сперматоцитов и сперматозоидовПатент на изобретение №: 2196820 Автор: Эрнст Л.К., Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., Соловьев Б.В., Самуйленко С.А., Еремец В.И. Патентообладатель: Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности Дата публикации: 20 Января, 2003 Начало действия патента: 22 Ноября, 2000 Адрес для переписки: 141142, Московская обл., г. Щёлково, п/о Кашинцево, ВНИТИБП Изобретение относится к биотехнологии. Способ размножения стромальных клеток тестикул (семенников), мужских половых зародышевых клеток, сперматогоний, сперматоцитов и сперматозоидов включает их выделение, адаптацию и культивирование вне организма, а также интеграцию (вшивание) в них генетического вектора. Размножение осуществляют в биореакторах поэтапно с использованием на каждом этапе культивирования питательных сред все более сложного состава, обогащенных фетальной сывороткой крупного рогатого скота (КРС), энергетическими, гормональными и ферментативными компонентами и поддерживанием физико-химических параметров на оптимальном для каждого этапа уровне. Способ позволяет получить сперматозоиды с генетическим вектором нужной направленности в промышленных масштабах вне организма. ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для размножения зародышевых клеток, внедрения (вшивания) генетического вектора нужной направленности и получения сперматозоидов с дополнительной генетической информацией для последующего получения трансгенных животных. Известен способ получения мышиных сперматогоний в течение четырех месяцев в культуре клеток in vitro, с последующим продолжением сперматогенеза после трансплантации этих клеток в семенные канальцы реципиента (Nagano M., Avarbock MR, Leonida ЕВ, Brinster C.J., Brinster RL, "Culture of mouse spermatogonial cells". 1: Tissue Cell 1998 Aug, 30 (4): 389-97). Однако указанный способ не обеспечивает однотипность сперматогоний и сформировавшихся сперматозоидов, поскольку они смешиваются со сперматозоидами реципиента, требует предварительного подавления иммунологической реактивности организма реципиента для профилактики отторжения донорских клеток, а также указанный способ не позволяет получать в промышленных масштабах указанные клетки. Целью заявляемого изобретения является накопление пула зародышевых клеток, внедрения генетического вектора нужной направленности в процессе их размножения и получения сперматозоидов с дополнительной генетической информацией для последующего получения трансгенных животных. Указанная цель достигается тем, что размножение клеток осуществляют в биреакторах поэтапно с использованием на каждом этапе культивирования питательных сред все более сложного состава, обогащенных фетальной сывороткой крупного рогатого скота (КРС), энергетическими, гормональными и ферментативными компонентами и поддерживанием физико-химических параметров на оптимальном для каждого этапа уровне. Способ осуществляют следующим образом. Пример 1. Берут семенники у эмбрионов и/или у молодых, и/или половозрелых особей с соблюдением асептики. Ткани семенников и придатков измельчают и диспергируют в солевом буферном растворе без кальция и магния и помещают в культуральные флаконы или биореакторы с культуральной средой следующего состава (в об%): фетальная сыворотка КРС - 5,0; эпидермальный ростовой фактор (ЭРФ) - 0,015; фактор роста (ИФР-1) - 0,015; соматомедин - А 0,001; аденозиндифосфат (АДФ) - 0,001; аденазинтрифосфат (АТФ) - 0,015; соматомедин В - 0,001; соматомедин С - 0,001; глюкоза - 0,1; 20% - водно-спиртовой экстракт тканей семенников, взятых в период наступления половой зрелости - 3,0 и среда 199 - остальное до 100. Культивируют смесь тестикулярных клеток эмбрионов, молодых и половозрелых особей и параллельно ведут раздельное культивирование клеток тестикул этих особей. Культивирование проводят при температуре 34 38oС; рН 7,07,4 ед.; рО2 3050% насыщения и еН 180-220 мВ. Продолжительность первого этапа культивирования зависит от начала появления сперматогоний в популяции клеток. Обычно на это уходит 72-96 часов. Деление мужских зародышевых клеток может происходить как в полисистеме (смесь тестикулярных клеток эмбрионов, молодых и половозрелых особей), так и в моносистеме (раздельное культивирование клеток тестикул этих особей). Пример 2. На втором этапе культивирование осуществляют в обогащенной питательной среде следующего состава (в об%): среда Игла - 40,0; фетальная сыворотка КРС - 10,0; эпидермальный ростовой фактор (ЭРФ) - 0,03; фактор роста (ИФР-2) - 0,03; инсулин 40 м. ед. на 1 л среды, глюкоза 0,15; лактоза 0,05; аденозинтрифосфат (АТФ) - 0,02; аденозиндифосфат (АДФ) - 0,02 и среда 199 - остальное до 100. Обеспечивают поверхность субстрата для опорозависимых клеток путем добавления макро- и/или микроносителей. Культивирование проводят при температуре 3438oС; рН 7,07,4 ед. ; рО2 3050% насыщения и еН 140180 мВ. В процессе культивирования проводят микроскопический контроль состава клеточной популяции. Продолжительность второго этапа культивирования зависит от степени репродукции и накопления сперматогоний. При достижении концентрации сперматогоний не менее 0,2 млн. в 1 мл среды и появлении сперматоцитов проводят интеграцию (вшивание) генетического вектора нужной направленности путем адсорбации вектора на поверхность сперматогоний и сперматоцитов с последующим проникновением в клетки. Пример 3. На третьем этапе культивирования используют среду следующего состава (в об%): среда 199-50; среда RPMJ - 1640-20; фетальная сыворотка КРС - 20; эпидермальный ростовой фактор (ЭРФ) - 0,015; фиторостовой фактор (ФРФ) - 0,015; фактор роста-2 (ИФР 2) - 0,015; фетуин - 0,015; трансферин - 0,015; глюкоза - 0,15; лактоза - 0,05; сахароза - 0,05; аденозинтрифосфат (АТФ) - 0,001; аденозиндифосфат (АДФ) - 0,001; сыворотка крови самцов соответствующего вида в период наступления половой зрелости 4,0; среда Игла - остальное до 100,0. Культивирование проводят при температуре 3335oС; рН 7,0-7,4 ед; pО2 30-50% насыщения и еН 140-180 мВ. Культивирование осуществляют в течение 15-45 суток. Регулярно через 48 часов проводят микроскопический и генетический контроль популяции клеток. При достижении концентрации сперматоцитов не менее 0,2 млн. в 1 мл среды и при обнаружении генетического вектора нужной направленности не менее чем у 90% клеток переходят к четвертому этапу культивирования. Пример 4. Сперматоциты концентрируют не менее чем в 10 раз и культивируют до полной дифференции клеток в зрелые сперматозоиды. Культивирование проводят в питательной среде следующего состава (в об%): среда 199-50; среда RPMJ-1640-20; фетальная сыворотка КРС - 20; эпидермальный ростовой фактор (ЭРФ) - 0,015; фиторостовой фактор (ФРФ) - 0,015; фактор роста 2 (ИФР-2) - 0,015; лактоза - 0,05; сахароза - 0,05; аденозинтрифосфат (АТФ) - 0,001; аденозиндифосфат (АДФ) - 0,001; сыворотка крови самцов соответствующего вида в период наступления половой зрелости - 4,0; триптозофосфатный бульон - 0,5; эмбриональный экстракт - 0,5; среда Игла - остальное до 100. Культивирование проводят при температуре 33-35oС; рН 7,0-7,4 ед.; рО2 30-50% насыщения и еН 140-180 мВ. В процессе четвертого этапа культивирования проводят микроскопический контроль популяции клеток. При морфологической зрелости спрематозоидов не менее чем в 90% случаев их концентрируют не менее чем в 10 раз и используют для формирования криобанка спермы с генетическим вектором. Сперматозоиды с генетическим вектором нужной направленности можно использовать для получения трансгенных животных. Преимущества заявляемого способа: 1. Заявляемый способ позволяет получить сперматозоиды с генетическим вектором нужной направленности в промышленных масштабах вне организма. 2. Заявляемый способ позволяет получить однородные популяции сперматозоидов с генетическим вектором нужной направленности и избежать феномена иммунологического отторжения донорских сперматогоний в организме реципиента.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯСпособ размножения стромальных клеток тестикул (семенников), мужских половых зародышевых клеток, сперматогоний, сперматоцитов и сперматозоидов, включающий их выделение, адаптацию и культивирование, а также интеграцию (вшивание) в них генетического вектора, отличающийся тем, что размножение осуществляют в биореакторах поэтапно с использованием на каждом этапе культивирования питательных сред все более сложного состава, обогащенных фетальной сывороткой крупного рогатого скота (КРС), энергетическими, гормональными и ферментативными компонентами и поддерживанием физико-химических параметров на оптимальном для каждого этапа уровне.Популярные патенты: 2059362 Установка для выращивания мидий ... с атмосферой при помощи статической трубки 30 через приемник 23 и отверстие, расположенное в приемнике 23. Под действием потока воздуха под поплавком создается повышенное давление, а над поплавком 27- пониженное. В результате чего поплавок 27 всплывает и при помощи стержня 28 контактирует с микропереключателем 29. Микропереключатель 29 соединен с электрическим звонком 31 и реле времени 32 при помощи электрической цепи. Реле времени 32 соединено соленоидом 33. Шток 34 соленоида 33 установлен так, что он контактирует с золотником 34, установленным на надувной камере 6. Установка работает следующим образом. Вдоль береговой линии моря на мелководье волн прибоя на илистых, песчаных ... 2120752 Способ консервирования ксеногенных клеток печени ... опубликовано: 20.10.2008 БИ: 29/2008 * ИЛ - исключительная лицензия НИЛ - неисключительная лицензия QZ4A - Регистрация изменений (дополнений) лицензионного договора на использование изобретения Лицензиар(ы): Гладских Лариса Валентиновна Вид лицензии*: НИЛ Лицензиат(ы): Закрытое акционерное общество "Медминипром" Характер внесенных изменений (дополнений): Изменение, не относящееся к сведениям, приведенным в патенте. Дата и номер государственной регистрации договора, в который внесены изменения: 08.09.2008 № РД0040569 Извещение опубликовано: ... 2462864 Устройство составления экономичного кормового рациона и экономичного кормления животных и птиц ... что прибыль в данном (старом) варианте управления по критерию максимальной продуктивности поголовья Пс получена небольшая Заявляемое вместе со способом экономически оптимального (экономически наилучшего) управления устройство автоматически выбирает такой режим расхода корма, при котором указанная экономически оптимальная разность всегда имеет наибольшее значение. Таким образом, при любых условиях кормоприготовления прибыль в новом варианте управления по критерию максимума прибыли Попт всегда максимальна Вычитая из второго значения разности по (6) ее первое значение по (5), получаем прирост прибыли (годовой, суточной, часовой и т.п. - какую именно решили выбрать для ... 2197082 Установка для охлаждения молока с использованием естественного холода ... для обработки хладоносителя, связанные с ними трубопроводы с запорными элементами, подсоединенные к теплообменнику с проходящим через него молокопроводом для подачи молока из приемного бака в накопительный резервуар (SU 1401239 А1, класс A 01 J 9/04, опубликовано 07.06.88). Эта установка принята в качестве ближайшего аналога. К недостаткам ее можно отнести то, что в ней охлаждение молока производится в теплообменнике, являющемся по существу накопительным резервуаром, размещенным, например, на предприятии, где молоко должно храниться в охлажденном состоянии до его дальнейшей переработки. Между тем, существует необходимость в первичном охлаждении молока. Свежевыдоенное молоко ... 2099929 Почвенная растительная смесь для культурных газонов и способ их создания ... слоя семян дернообразующих трав в почву вносят удобрения. Нормы внесения удобрений зависят от потребности растений в питательных веществах и от обеспеченности ими почвенного растительного слоя газона. Потребность растительного слоя в тех или иных химических элементах определяется ежегодными, регулярно проводимыми, в одно и то же время года, агрохимическими анализами почвы газона. Зная агрохимическую характеристику этой почвы, можно рассчитать, какое количество минеральных удобрений следует внести в каждом конкретном случае. Практика показывает, что органические удобрения следует вносить в почвенный растительный слой газонов очень осторожно. При внесении удобрений в ... |
Еще из этого раздела: 2264065 Способ возделывания сельскохозяйственных культур на корм 2492623 Портативный электроинструмент с управлением спусковым механизмом 2007901 Устройство для хранения овощей и фруктов 2071371 Способ нагрева тканей животного и устройство для его осуществления 2420940 Энергосберегающий способ обеззараживания семян люпина от антракноза 2388213 Способ измерения урожайности травяного покрова 2411718 Устройство для внутрипочвенного импульсного дискретного полива растений 2464784 Защитный слой для растений и деревьев, его изготовление и его применение 2138949 Комбинированный препарат для борьбы с таежными и лесными клещами, способ борьбы и аттрактант 2127256 Замещенные простые оксимовые эфиры и фунгицидное, инсектицидное, арахноицидное средство |
Изобретения в сельском хозяйстве
Обработка почвы в сельском и лесном хозяйствах
Посадка, посев, удобрение
Уборка урожая, жатва
Обработка и хранение продуктов полеводства и садоводства
Садоводство, разведение овощей, цветов, риса, фруктов, винограда, лесное хозяйство
Новые виды растений или способы их выращивания
Производство молочных продуктов
Животноводство, разведение и содержание птицы, рыбы, насекомых, рыбоводство, рыболовство
Поимка, отлов или отпугивание животных
Консервирование туш животных, или растений или их частей
Биоцидная, репеллентная, аттрактантная или регулирующая рост растений активность химических соединений или препаратов
Хлебопекарные печи, машины и прочее оборудование для хлебопечения
Машины или оборудование для приготовления или обработки теста
Обработка муки или теста для выпечки, способы выпечки, мучные изделия
|
|
||