Способ скрининга потенциального противогрибкового агента, противогрибковый агент (варианты), сельскохозяйственная противогрибковая композиция и способ ингибирования грибкового поражения растенийПатент на изобретение №: 2108038 Автор: Мария Фаттори[IT], Стефан Ренат Мария Хореманс[BE], Марк Лефевр[BE], Кит Адриан Пауэлл[GB], Аннабель Ренвик[GB] Патентообладатель: Зенека Лимитед (GB) Дата публикации: 10 Апреля, 1998 Адрес для переписки: подача заявки16.10.1990 публикация патента10.04.1998 Изображения    Изобретение относится к производству фунгицидных средств, используемых для защиты растений от грибковых заболеваний, и касается способа скрининга противогрибкового агента (фунгицида), противогрибкового агента, композиции на основе полученного противогрибкового агента и применения их для ингибирования грибкового поражения растений. Способ скрининга противогрибкового агента предусматривает приготовление патогенного мицелия вида Pythium в слое культуральной среды, помещение слоя стерильной почвы на выросший мицелий, добавление в почву исследуемого противогрибкового агента, инкубирование смеси и оценку ингибирующего действия противогрибкового агента на рост патогенного гриба. Отбирают противогрибковый агент, полностью подавляющий рост гриба в почве. Полученный противогрибковый агент дополнительно исследуют на зараженное патогеном растение. Для этого инокулируют образец почвы патогенным грибком, например Aphanomyces cochlioides, Pythium ultimum, засевают в зараженную почву семена растений, восприимчивых к заражению грибком, соответственно семена сахарной свеклы, гороха, вносят в почву исследуемое противогрибковое средство, проращивают семена и выращивают растение и затем оценивают ингибирующее действие противогрибкового агента путем сравнения состояния зараженных растений с незараженными растениями. На основании вышеописанного способа отобраны штаммы бактерий Pseudomonas fluorescens N C 1 B 40186, N C 1 B 40187, NC 1 B 40188, N C 1 B 40190, создана композиция, содержащая один из вышеуказанных штаммов бактерий и носитель. Один из вышеуказанных штаммов бактерий или композицию используют для ингибирования грибковых поражений растений путем их обработки. 7 с. и 5 з.п.ф-лы, 3 ил., 3 табл. , , , ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУИзобретение касается способа скрининга потенциального противогрибкового агента посредством оценки ингибирующего действия указанного агента на грибковое заражение двумя тестами, а также новых противогрибковых агентов, сельскохозяйственной противогрибковой композиции, использующей эти агенты в качестве активного начала, а также способа ингибирования грибкового поражения растений. По нашему опыту традиционный первичный отбор не обеспечивает ни должный, ни достаточный отбор изолятов, которые могли бы пройти последующий скрининг и полевые испытания. Традиционный первичный отбор выдерживает большое число изолятов (как правило, порядка 20%), что указывает на их перспективность, однако в результате последующих испытаний большинство из них оказывается отвернутыми. Известен способ скрининга противогрибкового агента, предусматривающий оценку ингибирующего действия исследуемого противогрибкового агента на грибковое заражение двумя тестами, второй из которых осуществляют путем инокулирования образца почвы патогенным грибком, засевания в зараженную грибком почву семян растений, восприимчивых к заражению этим грибком, внесения в почву исследуемого противогрибкового агента, проращивания семян и выращивания растений, при этом оценку ингибирующего действия противогрибкового агента проводят посредством сравнения состояния выращенных зараженных растений с незараженными контрольными растениями. Недостатки известного способа типичны и в целом уже описаны выше. В связи с изложенным понятно, что существует потребность в новом способе отбора изолятов почвы, который позволял бы выявлять большое количество потенциально хороших изолятов и отвергать как можно больше материалов с низкой активностью. Для этого предлагается способ описанного типа для отбора потенциальных фунгицидных агентов, имеющий, согласно изобретению, те особенности, что первый тест оценки ингибирующего действия противогрибкового агента предусматривает приготовление патогенного мицелия вида Pythium в слое культуральной среды, помещение слоя стерильной почвы на выросший мицелий, добавление в почву аликвоты исследуемого противогрибкового агента, инкубирование смеси и оценку ингибирующего действия противогрибкового агента на рост патогенного гриба. Растение, восприимчивое к заражению грибком, может представлять собой сахарную свеклу, а противогрибковый агент представляет собой микроорганизм. Микроорганизм обычно выделяют из корней растений. Выделение противогрибкового микроорганизма предпочтительно осуществляют путем помещения в контейнер слоя влажного стерильного песка, нанесения на него образца влажной почвы, посева в почву семян растений, восприимчивых к интересующему грибковому заболеванию, герметизацию контейнера, выращивание растений в условиях, способствующих развитию у них заболевания, до образования корней, проходящих из слоя почвы в слой песка, разрезание контейнера продольно через оба слоя почвы и песка, извлечение корней только из слоя песка и выделение микроорганизмов из извлеченных корней. Хотя изобретение было разработано конкретно для скрининга микроорганизмов в образцах почвы, тем не менее нет препятствий для его использования с целью отбора подходящих химических противогрибковых агентов. Предпочтительно, агент, проявляющий ингибирующее действие на патогенный гриб в первых двух тестах, дополнительно подвергают скринингу, используя свеклу, зараженную грибком Aphanomyces cochlioides при 12 - 15oC, семена гороха, зараженные грибком Phytiim ultimum при 12 - 15oC, семена гороха, зараженные грибком Phytiim ultimum при 24 - 27oC, семена гороха, зараженные грибком Rhizoctonia solani при температуре 24 - 27oC, семена пшеницы, зараженные грибком Fusarium culmorum при 18 - 21oC, семена соевых бобов, зараженные грибком Phytophtora megasperma при 20 - 24oC, резаные клубни картофеля, зараженные грибком Fusarium moliniforme при 20 - 24oC, резаные клубни картофеля, зараженные грибком Fusarium sambusinum при 20-24oC, и свеклу, зараженную грибком вида Phoma при 15 - 19oC. Таким образом, если свести вместе все возможные компоненты изобретения, можно выделить потенциальные АБК по способу, предназначенному только для выделения организмов, активность которых связана с корнями, отобранных в двух предварительных испытаниях, которые идентифицируют организмы с высокой потенциальной активностью, после чего организмы сортируются в ряде жестких тестов, идентифицирующих агенты, которые впоследствии оказываются высокоактивными при проведении испытаний в разнообразных полевых условиях. Это представляет основное преимущество по сравнению с традиционными способами, которые, как установлено ранее, отвергают организмы, успешно выдерживающие тесты по изобретению, и пропускают очень большое количество организмов, которые по данным испытаний изобретения по большей части неактивны или менее активны по сравнению с контролем. Изобретение далее включает фунгицидный агент, проявляющий такую же или более высокую активность подавления грибковой инфекции по сравнению с сопоставимым химическим агентом, что показывают упомянутые сортировочные испытания по изобретению. По предлагаемому способу нами выделено и оценено четыре микроорганизма, по нашим данным особенно активных против ряда вызываемых грибами заболеваний, как правило, связанных с выпреванием, и, следовательно, изобретение включает также фунгицидные агенты, включая микроорганизмы вида Peseudomonas fluorescence, штаммы которого депонированы 1 сентября 1989 г. в соответствии с Будапештским договором, и Национальной коллекции промышленных и морских бактерий (National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited, Aberdeen, United Kingdom) с депозитарными номерами 40186, 40187, 40188 и 40190. Изобретение также включает фунгицидную сельскохозяйственную композицию, содержащую в качестве активного компонента любой, один или более, из указанных микроорганизмов в смеси с композицией носителей, приемлемой для сельскохозяйственной практики. Примерами типов сельскохозяйственных композиций, применение которых возможно, включают композиции для нанесения покрытия на семена, жидкости для смачивания корней или почвы, а также гранулированные или порошкообразные композиции. Основные материалы этих композиций хорошо известны. Как пример эффективности отбора по изобретению, мы использовали традиционный метод in vitro для скрининга 7000 изолятов и обнаружили, что скорость "прохождения" составила около 20%, тогда как испытания по нашему изобретению прошло только 4 - 5% изолятов. Однако важным моментом является тот факт, что микроорганизмы, прошедшие каждый из двух минимальных тестов по изобретению, очень похожи, тогда как метод традиционного скрининга на агаре пропускает совершенно различные микроорганизмы. Некоторые микроорганизмы, которые могли бы быть отвергнутыми, если положиться на данные традиционного метода сортировки, показали высокую активность в последующих испытаниях сортировки и в полевых условиях. В этом заключается основное принципиальное преимущество изобретения: первоначальный скрининг уменьшает общее число организмов, нуждающихся в дальнейшем скрининге, и большая часть организмов, представленных для дальнейшего скрининга, впоследствии при полевых испытаниях проявляет высокую искомую активность. Мы полагаем, что причиной этого является следующее. Условия проведения испытаний, например температура и питательный состав, для традиционного метода оптимизируются так, чтобы способствовать росту микроорганизмов на агаре: такое содержание очень сильно отличается от жестких реальных условий окружающей среды, в которых предполагается использовать микроорганизмы. Следовательно, многие микроорганизмы, прошедшие первый скрининг, вообще оказываются слабыми, могут выжить только в "тепличных" условиях культуры агара и впоследствии не выдерживают, когда более жесткие повторные и последующие скрининги проводятся в условиях, более близких к реальным полевым. С другой стороны, в серии изолятов всегда должны быть, и наш опыт показывает, что это именно так, штаммы микроорганизмов, предпочитающие полевые условия, где, например, ниже температура или меньше питательных веществ, или другой состав питательных веществ. Такие микроорганизмы плохо развиваются на агаре и обычно их отвергают. Доказательством этого является то, что два скрининга, которые являются основой изобретения, ближе к полевым условиям и поэтому дают более реалистичное указание на способность микроорганизмов процветать в условиях, соответствующих их предполагаемому применению. Изобретение также обеспечивает способ подавления грибкового заболевания, включающий нанесение на растение, его семя или на среду выращивания эффективной дозы фунгицидного агента по изобретению. Изобретение обеспечивает также способ защиты культурных растений от грибковой инфекции, включающий нанесение на растения, их корни или семена либо на окружающую растения почву дозировки, обеспечивающей фунгицидный эффект, одного или более штаммов указанного Pseudomonas fluorescence. Штамм NCIB 40187 выделен из корней пшеницы, собранных от растений, выращенных на полях Великобритании (Badbury 2, Draycott Farm, Chiseldon, Swindon, Wiltshire). Штаммы NCIB 40186 и 40188 были выделены из почвы, взятой на полях Бельгии (Stockoy Field, Jodoigne). Штамм NCIN 40190 был выделен из корней ростков пшеницы, полученных с полей Lower Garston, Rushall Farm, Newbury, U.K. Далее следует описание выделения, характеристики и скрининга бактериальных изолятов на предмет установления их активности против некоторых грибов, которые инфицируют культурные растения. Было выделено очень большое число микроорганизмов, идентифицировано и отсортировано описанным выше способом, причем четыре штамма по изобретению было отобрано из-за выдающихся характеристик при скрининговых испытаниях. Выделение микроорганизмов. Используют пробирку из диализной трубки длиной 35 см и шириной 5,5 см, причем на расстоянии 5 - 7 см от одного конца сделан узел. Тонкий песок промывают, высушивают и насыпают трубку на глубину 12 см и увлажняют 20 мл дистиллированной воды. Трубки с песком размещают внутри стеклянных трубок (диаметром 7 см и глубиной 30 см) для поддержки. Затем трубки закрывают снизу с помощью резиновой пробки, покрытой алюминиевой фольгой, и сверху - тампоном из хлопкового волокна, после чего обертывают алюминиевой фольгой. Все трубки выдерживают в автоклаве при 121oC в течение 60 мин. С целевого места отбирают пробы почвы и выдерживают их при влажности 40% при 4oC до использования, в пределах двух дней после сбора. Пробы почвы просеивают через сито 4 мм и добавляют в трубки до глубины 3 см поверх песка. Засевают семена (горох, пшеница, сахарная свекла, подсолнечник, кукуруза или соевые бобы) и покрывают слоем почвы до общей глубины 6 см. Трубки помещают вертикально в проволочную корзину, которую затем помещают в пластиковый контейнер с дырками, что обеспечивает воздухообмен и сводит до минимума потери влаги испарением. Корзины затем располагают в камеру для выращивания и выдерживают в течение четырех недель при 10-24oC и при относительной влажности 70% при цикле 16-ти часовой день/8-ми часовая ночь. После выдержки в течение четырех недель пластиковые диализные трубки открывают с помощью предварительно стерилизованного скальпеля. Корни каждого растения освобождают от почвы и песка, и растения помещают в белый пластмассовый лоток. Отрезают крону и верхушки растений и промывают отдельно стерильной водой. Отрезанные части помещают в стерильные колбы Эрленмейера, в которых содержится 20 мл деионизованной воды и слой стеклянных шариков. Затем колбы встряхивают в орбитальном термостате при 120 об/мин в течение 30 мин. Используя неразбавленный раствор из колб, полученный от промывки корней и корней и крон, приготавливают разбавление 1 : 9 в стерильном растворе Рингера до разбавления 10-3. Затем аликвоты по 100 мл от каждого раствора размазывают по поверхности трех агаровых сред следующего состава: 1/10 триптон - соевый агар. Триптон - соевый бульон - 3,0 г Бактериологический агар - 17,5 г Деионизованная вода - 1000 мл (Среду выдерживают в автоклаве при 121oC в течение 15 мин). Агар с корневым экстрактом. Свежие корни пшеницы - 10 г Агар N 3 - 17,5 г Деионизированная вода - 1000 мл (Свежие корни взвешивают и смешивают с малым количеством деионизированной воды, используя для этого хороший смеситель. Затем помещают густую суспензию в сумку, состоящую из четырех слоев плотного муслина, после чего приготавливают суспензию в остатке деионизированной воды в двухлитровом стакане и выдерживают при 20oC в течение 4 дней. Затем муслиновую сумку вынимают и к корневому экстракту добавляют агар. Питательную среду затем выдерживают в автоклаве в течение 15 мин при 121oC. Агар с почвенным экстрактом. Проба почвы - 10 г Агар N 3 - 17,5 г Деионизированная вода - 1000 мл (Почву взвешивают и помещают в деионизированную воду в двухлитровый стакан. Выделяют суспензию почвы и термостатируют при 20oC в течение четырех дней, после чего удаляют воду через четыре слоя плотного муслина. Затем добавляют агар и выдерживают питательную среду в автоклаве при 121oC в течение 15 мин). Делают три копии каждого разбавления. Чашки с агаром термостатируют при 12oC в продолжение периода времени до 5 дней, после чего считают и регистрируют число колоний на каждой чашке. Где это было возможно, для каждого растения, каждой ниши и агаровой комбинации берут чашку, в которой содержится пятьдесят или менее колоний. Когда такой возможности нет, то на каждую чашку наносят решетку с пятьюдесятью пересечениями и отбирают колонии, оказавшиеся на или вблизи от каждого пересечения. Таким образом, отбор колоний является совершенно случайным. Индивидуальные колонии снимают с чашек с помощью стерильной петли и пересеивают на чашки Петри диаметром 5 см, в которых находился 1/10 триптон - соевый агар (1/10 TSA). Затем чашки термостатируют при 12oC в течение 5 дней. Затем изоляты проверяют на чистоту. Там, где была обнаружена смешанная культура, делают посев изолята штрихом на скошенном 1/10 TSA, чтобы получить отдельные колонии. Выбирают одну колонию и пересевают на 1/10 TSA. Коллекцию культур хранят при 4oC. Характеристика микроорганизма. Морфология. Микроорганизм отличается следующими морфологическими характеристиками. Морфология клетки: Грамм - отрицательные палочки. Морфология колонии: NCIB 40186 не совсем белая, круглая, правильная, целая, мало выпуклая, гладкая, блестящая, полупрозрачная, диаметром 1,5 - 2 мм. CIB 40187: не совсем белая, круглая, правильной формы, целостная, приподнятая, гладкая, блестящая, полупрозрачная, диаметром 1 мм. CIB 40188: не совсем белого цвета, круглая, правильной формы, слегка выпуклая, гладкая, блестящая, целая, полупрозрачная, диаметром 1,5 - 2 мм. CIB 40190: не совсем белого цвета, круглая, правильной формы, целая, плоская, гладкая, блестящая, полупрозрачная, диаметром 1 мм. Температура роста: Все штаммы 37oC - +ve 41oC - -ve 45oC - -ve Флюоресценция. Все штаммы +ve. Каталаза. Все штаммы +ve. Оксидаза. Все штаммы +ve. Ферментация в глюкозе OF. Все штаммы + ve. Экспресс - тест /API/. Характеристика микроорганизма представлена в табл.1. Первичная сортировка Сортировка на почве в чашках Петри. Чашки Петри (диаметром 5 см) наполняют 10 мл агара картофельной декстрозы (PDA). В центре PDA помещают агаровые бляшки (5 мм), взятые из семидневной культуры Pythium ultimum, выращенной при 20oC. Чашки термостатируют при 20oC в течение 5 дней, в продолжение которых в чашке развивается культура P.ultimum. Выдерживают в автоклаве в течение 60 мин при 120oC (Minster Mendip Loam). К нему добавляют семена пшеницы (1 мас./мас.%) и хорошо перемешивают. В каждую чашку Петри помещают около 8 г почвы, так, чтобы покрыть область распространения Pythium. Бактерии для проведения теста выращивают на 1/10 TSB или в чашках с 1/10 TSA в течение 48 ч при 12oC. В каждую чашку Петри вносят 2 мл культуры: приготавливают дубликаты чашек. Обработка. Только 1/10 TSB. Металаксил (100 ppm). Испытываемый организм. 1/10 TSB, добавленный к почве на PDA, не засеянный Pythium. Тарелки термостатируют в течение 4 дней при 10oC. Активность, которую оценивают по шкале от 0 до 3, выбирают на согласовании полного подавления роста грибов в почве. Сортировка Fuzarium на картофеле. Диск стерильной фильтровальной бумаги (диаметром 9 см) тщательно увлажняют водой и помещают на дно стерильной чашки Петри. Для каждой обработки приготавливают по две чашки Культуры Fuzarium [Fuzarium Sambusinum, Fuzarium culmorum и Fuzarium moniliforme], выращивают на картофельной декстрозе в течение 14 дней при 20oC на свету, так чтобы получить конидии. Затем приготавливают суспензию конидий в стерильном физиологическом растворе (0,85%) и доводят до величины пропускания 20% при 420 нм спектрофотометра. Половину петли с бактериями, выращенными на питательном агаре (Oxoid) в течение 24 ч при 20oC, суспендируют в 2,5 мл стерильного физиологического раствора. В качестве контроля приготавливают каптан с концентрацией 2,0 г/л. В качестве контроля используют также чистый физиологический раствор. В стерильную пробирку микроцентрифуги помещают суспензию Fuzarium (50 мл), по одной пробирке на каждую обработку. Один ломтик картофеля толщиной менее 10 мм, в котором прорезано с помощью пробочного сверла диаметром 10 мм четыре отверстия, помещают в каждую чашку Петри. Поверхность ломтика картофеля стерилизуют этанолом и высушивают стерильной фильтровальной бумагой. Ломтики используют не позднее чем через 30 мин после отрезания (или через 60 мин, если выдерживать при 4oC). Пробу суспензии спор, объемом 50 мл (106 конидий/мл) поместили в три из четырех отверстий в картофельном ломтике. Пробу бактериальной суспензии (50 мл, приблизительно 108 клеток на 1 мл) смешивают с суспензией Fuzarium в одном из трех отверстий, в другом - беномил при концентрации 100 ppm, а третье отверстие служит незасеянным контролем. Чашки Петри закрывают крышками и термостатируют в течение 3 дней при 20oC. Уровень заражения тканей вычисляют по субъективной шкале от 0 до 3. Сортировка по отношению к Phoma Betae Куски сахарной свеклы размером 2,5 2,5 1,5 мм вырезают изнутри корня и увлажняют приблизительно 13 мл стерильной воды в пластмассовом контейнере. На поверхность кусков выливают пробу культуры Phoma Betae вместе с или без микроорганизма, предположительно обладающего фунгицидной активностью, после чего куски термостатируют в течение 3 недель. В конце термостатирования пробы свеклы оценивают на гниение. Сортировка сахарной свеклы/почва. Естественную почву, которая, как известно, вызывает "выпревание" сахарной свеклы, доводят до влажности 45%. Голые семена сахарной свеклы и семена, покрытые испытываемыми бактериями, засевают в почву. Пробы затем термостатируют в течение 10 дней, освещая в течение 12 ч в день при 15oC. Фунгицидную активность бактерий оценивают по числу появившихся ростков по сравнению с химическим контролем - Tachigaren/TMTD., Повторный скрининг. Для испытания эффективности выбранных микроорганизмов используют два вида: Phytium ultimum и Rhizoctonia solani. Культуры P.ultimum и R. solani выращивают на планшете с PDA в течение 7 дней при 20oC. Смесь, состоящую из 200 г серебряного песка, 5 г кукурузной муки, 4 г Beemax пшеничных зерен и 40 мл воды, выдерживают в автоклаве при 120oC в течение 20 мин, затем помещают в колбу и засеивают 1/4 тарелки Phytium. Такой же субстрат, но без кукурузной муки, используют для Rhizoctonia. Колбы термостатируют при 20oC в течение 7 дней. Ряд разбавлений. Содержимое каждой колбы с Phytium ultimum, смешивают с тонким песком, доведя вес до 300 г. Одна колба Phytium в 8 л Mendip Minster Loam = двунормальная /2 N/ смесь. Смесь разбавляют чистой Mendip Loam, так чтобы получить требуемые дальнейшие разбавления. Изоляты подвергают обычной сортировке по отношению к Phythium при разбавлениях N/8 и N/32 при 12-15oC. 3/4 Колбы инокулята Rhizoctohia solani в 6 л Mendip Minster Loam = нормальная смесь. При сортировке используют концентрации N/4 и N/16. Испытания проводят на трехдюймовых горшках, наполненных на 3/4 инфицированной почвой. В каждый горшок сажают пять горошин и покрывают их чистой почвой. В качестве промочки в каждый горшок добавляют 35 мл воды или бактериальной суспензии. Для каждой обработки приготавливают пять копий. Для АБК - скрининга бактерии выращивают в течение 48 ч при 20oC на 1/10 TSB. В горшки добавляют всю суспензию (35 мл). Контролем служат, как правило, 1/10 TSB и химические агенты. В качестве орошения добавляют: ренцикурон в концентрациях 10, 100 или 200 ppm к Rhyzoctonia, металаксил - к Phytium в концентрации 100 ppm. Растения для теста выращивают: для R. solani - в течение 7 - 14 дней при 20-25oC, а для Phytium - в течение 14 дней при 12 - 15oC. Еженедельно проверяют появление ростков. Растения ежедневно поливают. Особое внимание уделяют тому, чтобы при проведении испытаний почва была влажной, так как оба заболевания вызывают выпревание. Скрининг по Phytophthora megasperma. Бляшку диаметром 5 мм, взятую из планшета с культурой P. megasperma, выращивают на планшете диаметром 9 см на среде V - 8 в течение 13 дней при 25oC. Среда V - 8 представляет собой композицию следующего состава: Сок V-8 Compbell - 180 мл CaCO3 - 2,7 г Дистиллированная вода - 720 мл Агар Difco - 13,5 г (Компоненты, кроме агара, смешивают и нагревают паром в течение 30 мин, отфильтровывают, доводят pH до 7,2 добавляют агар и стерилизуют среду при 120oC в течение 20 мин). Влажное просо (50 г плюс 20 мл дистиллированной воды) дважды стерилизуют при 110oC в течение 45 мин. Пластинку с 1/4 P. megasperma помещают вверх дном на поверхность проса и термостатируют в темноте в течение 28 дней при 25oC. Просо, инфицированное P. megasperma (массой 22,5 г), тщательно смешивают в гомогенизаторе со стерилизованной почвой (1477,5 г) и водой (112,5 г). Использованная почва представляет собой смесь 1:1:1 (об/об) серебряного песка, полевой почвы с pH 7 и торфа, образовавшегося из лиственного мха; смесь стерилизуют при 100oC в течение 1 ч. Смесь инфицированного проса и почвы в количестве 500 г помещают в склянки Леонарда, которые затем закрывают пластиковыми пластинами и оставляют до надобности. Водяной резервуар на дне склянки Леонарда заполняют 100 мл дистиллированной воды. На поверхности смеси просо/почва делают четыре отверстия для посева, в каждое кладут соевый боб (c.v.Azzurra) и накрывают окружающей смесью. Приготавливают культуры испытываемых организмов на пластинах с питательным агаром, которые выдерживают при 28oC в течение 24 ч и в NB колбах емкостью 250 мл (150 мл NB), которые выдерживают в течение 24 ч при 28oC. Пробу культуры 75 мл центрифугируют при 8000 об/мин в течение 5 мин при 20oC. Снимают супернатант, добавляют следующую пробу 75 мл, еще раз центрифугируют и снова снимают супернатант. Оставшуюся в центрифуге лепешку несколько раз промывают 5 мл порциями физиологического раствора (9,2 г/л). Наконец, лепешку диспергируют в 150 мл физиологического раствора. В каждую склянку Леонарда впрыскивают, с помощью 60-ти мл шприца 30 мл суспензии в физиологическом растворе. Для сравнения с химическими агентами в склянки Леонарда, используемые в качестве контроля, вводят 30 мл пробы раствора 285,5 г металаксила 35% (торговая марка APRON) в 500 мл дистиллированной воды. Неинфицированный контроль получают также на пробах неинфицированной смеси просо/почва. Семена затем проращивают в камере роста при 20 2oC при освещенности 15 - 17 люкс. Оценку осуществляют путем сравнения процента появления ростков с химическим контролем. Скрининг Culmorum Fuzarium. Культуру Fuzarium culmorum выращивают на PDA в течение 10 дней при 20oC, что обеспечивало образование конидий. Конидии собирают и подсчитывают до интервала концентраций 104 - 108 конидий на 1 мл. Из этого источника добавляют 5 мл к 100 г семян пшеницы, находящихся в бутылке, которую затем вращают в течение ночи при 10oC. Пробу инфицированного семени вводят в смесь испытываемых бактерий и серебряного песка за 60 мин до посева, так чтобы на каждом семени образовалось покрытие из приблизительно 106 клеток на каждое семя. Вторую пробу обрабатывают беномилом (100 ppm) - она представляет собой химический контроль. Сто семян засевают в компост на основе торфа в лоток для рассады, на глубину 2 см. Компост поливают в начале испытаний, выдерживали при 20oC в течение 2 недель и поливают снова на пятый день после посева. После этого первоначального полива компоста, цель которого вызвать прорастание семян, компост оставляют высыхать, чтобы вызвать развитие заболевания. Рассаду проверяют на ускорение и развитие заболевания. Симптомы заболевания оценивают по шкале от нуля (симптомы отсутствуют) до 4 (серьезное заболевание). Результаты. По вышеописанным тестам подвергнуто скринингу около 7000 бактериальных изолятов почвы. В табл. 2 представлены результаты этих тестов. Цифры в столбцах соответствуют шкале от 0 (фунгицидный эффект отсутствует) до 3 (симптомы заболевания не различимы). В табл. 2 также включен сравнительный пример типичного неэффективного штамма бактерий, который обозначен как 53/87. Данные полевых опытов 1989. Штаммы, оказавшиеся самыми перспективными по данным первичной и вторичной сортировок, отбирают для проведения полевых опытов на активность в качестве агентов биологического контроля заболеваний "выпревания" у гороха и сахарной свеклы. Фиг. 1 иллюстрирует результаты, полученные для штамма NCIB 40186, относительно подавления выпревания гороха. Полевые испытания проводились в Великобритании. Данный штамм продемонстрировал контроль заболевания на уровне около 80% от контроля, достигаемого при химической обработке металаксилом (APRON, торговая марка). Штамм NCIB 40187 оказался по большей части неэффективным в данных испытаниях. На фиг. 2 и 3 показаны результаты полевых опытов на сахарной свекле, в которых использовались штаммы NCIB 40186 и 40190. Эти опыты проводились в Бельгии. Было выбрано шесть областей на поле. Три области (1, 3 и 6) были засеяны сахарной свеклой в марте, тогда как остальные три области - в мае. На фиг. 2 приведены результаты первого подсчета, который был сделан через 3 недели после посева, а на фиг. 3 - результаты, полученные через 6 - 8 недель после посева. Короче говоря, полученные результаты показывают, что выпревание у гороха, вызываемое Phytium ultimum снижается при нанесении штамма NCIB 40186 в степени, сравнимой с той, которая достигается при химической обработке металаксилом. Результаты, полученные на сахарной свекле, показывают, что при использовании штаммов NCIB 40186 и 40190 укоренение рассады улучшается по сравнению с необработанным контролем во всех шести областях. В трех областях укоренение рассады в присутствии указанных штаммов было сравнимо с тем, которое обеспечивает использование металаксила. Данные полевых опытов за 1990 г. В 1990 г. полевые испытания микроорганизмов штаммов NCIB 40186 и 40190 проводились для выявления их способности подавлять Pythium spp. Испытания проводились в Соединенных Штатах Америки, в Бельгии и во Франции, и результаты их проводятся ниже. Для испытания микроорганизмы наносили в виде пропитки семян, после чего семена сушили в песке для опытов в Европе, а также в виде формулы смола/торф для испытаний в США. Затем испытания продолжали в других частях света, в которых заболевания "выпревания" являются эндемическими, например, на растительных культурах в Малайзии. Несмотря на то, что мы не имеем возможности представить результаты испытаний по всему свету, просто вследствие того, что они еще не закончены и что должно быть принято во внимание, не могут быть ускорены вследствие сезонной структуры сельскохозяйственных процессов, от наших испытателей получены благоприятные предварительные указания, так что по крайней мере эти конкретные микроорганизмы обладают большой потенциальной возможностью для применения в качестве промышленных агентов биологического контроля. Дальнейшие испытания других упомянутых здесь микроорганизмов продолжается в лаборатории и в камере роста в соответствии с обычной практикой обеспечения эффективности и безопасности одновременно и для человека, и для окружающей среды. Имеющиеся в настоящее время результаты подтверждают выявленные ранее перспективы и соответствуют приведенным здесь данным. Штаммы NCIB 40186 и 40190 испытывали на подавление выпревания у сахарной свеклы, в опытах на девяти делянках в Бельгии и во Франции. Когда посев производили ранней весной, погода была очень теплой и сухой, что затрудняет развитие выпревания у сахарной свеклы. На каждой из опытных делянок было посеяно всего 200 семян. В настоящее время имеются результаты по девяти опытам. Опыты в Бельгии и во Франции 1990 г. Культура, на которой проводили испытания: сахарная свекла. Химический контроль: тахигарен/ТМДТ (см. табл. 3). Опыты во Франции 1990 г. Культура, на которой проводились испытания: горох. Химический контроль: показано ниже. Число растений относится к среднему числу растений, взошедших на полосе длиной 5 м через 22 дня после обработки. В столбце 2 табл. 3 приводится число растений, которое появилось из 200 семян через 22 дня после посева. Буквы после чисел указывают на статистическую значимость. Между обозначениями, содержащими общую букву, нет существенной разницы при 5%-ной вероятности. Контрольные обработки. Испытания проводились в обычной полевой почве без добавления патогенов. Обработка - Число всходов Необработанное семя - 172,58 AC NCIB 40186 - 107 клеток на семя - 184,75 A APRON -30 г.а.i/100 кг семян - 171, 50 AC PIDOMII 2E - полив борозды металаксилом - 181,00 A Контрольный опыт 100 клеток/семя - 176,00 AC Обработка тестов Внесли патоген (Pythium) со скоростью 200 г/м ряда. Обработка - Число всходов Необработанные семена - 111,25 I NCIB 40186- 107 клеток на семя - 144,75 DG APRON - 30 г а. i/100 кг семян - 157,25 BCDF PID OMII 2E полив борозды металаксилом - 164,25 AD Контрольные семена 100 клеток/семя - 119,88 HI Опыты в Калифорнии (США) 1990 г. Культура: горох Патоген: Pythium при 30 г/м ряда. Обработка - Взошло,% Патоген не вносили, без обработки - 93,13 AB Патоген + NCIB 40186 - 107 клеток/семя - 75,31 BCD Патоген + контрольные семена - 100 клеток/семя - 51,56 EF Патоген + APRON - 30 г а. i/100 кг - 92,81 AB Миссисипи (США), 1990 г. Культура: кукуруза. Патоген: Fuzarium /I/ при 10 г/м ряда, /II/ при 30 г/м ряда. Всхожесть оценивали в процентах через 15 дней после посева. Обработка - Взошло,% Патоген не вносили, без обработки - 65,833 C Патоген не вносили NCIB 40186 107 клеток/семя - 67,917 C Патоген не вносили, использовали CAPTAN для обработки семян - 69,583 BC Патоген /I/, без обработки - 51,250 D Патоген /I/ + NCID 40186 - 107 клеток/семя - 80,000 AB Патоген /II/, без обработки - 69,375 BC Патоген /II/ + NCIB 40186 - 107 клеток/семя - 82,708 A Патоген /II/ + CAPTAN для обработки семян - 63,958 Cс
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ скрининга потенциального противогрибкового агента, предусматривающий оценку ингибирующего действия исследуемого противогрибкового агента на грибковое заражение двумя тестами, второй из которых осуществляют путем инокулирования образца почвы патогенным грибком, засевания в зараженную грибком почву семян растений, восприимчивых к заражению этим грибком, внесения в почву исследуемого противогрибкового агента, проращивания семян и выращивания растений, при этом оценку ингибирующего действия противогрибкового агента проводят посредством сравнения состояния выращенных зараженных растений с незараженными контрольными растениями, отличающийся тем, что первый тест оценки ингибирующего действия противогрибкового агента предусматривает приготовление патогенного мицелия вида Pythium в слое культуральной среды, помещение слоя стерильной почвы на выросший мицелий, добавление в почву аликвоты исследуемого противогрибкового агента, инкубирование смеси и оценку ингибирующего действия противогрибкового агента на рост патогенного гриба. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что растение, восприимчивое к заражению грибком, представляет собой сахарную свеклу. 3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что противогрибковый агент представляет собой микроорганизм. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что противогрибковый микроорганизм выделяют из корней растений. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что выделение противогрибкового микроорганизма осуществляют путем помещения в контейнер слоя влажного стерильного песка, нанесения на него образца влажной почвы, посева в почву семян растений, восприимчивых к интересующему грибковому заболеванию, герметизацию контейнера, выращивание растений в условиях, способствующих развитию у них заболевания, до образования корней, проходящих из слоя почвы в слой песка, разрезание контейнера продольно через оба слоя почвы и песка, извлечение корней только из слоя песка и выделение микроорганизмов из извлеченных корней. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что агент, проявляющий ингибирующее действие на патогенный гриб в первых двух тестах, дополнительно подвергают скринингу, используя свеклу, зараженную грибом Aphanomyces cochlioides, при температуре 12 - 15oС, семена гороха, зараженные грибком Pythium ultimum, при температуре 12 - 15oС, семена гороха, зараженные грибком Pythium ultimum, при температуре 24 - 27oС, семена гороха, зараженные грибком Rhizoctonia solani, при температуре 24 - 27oС, семена пшеницы, зараженные грибком Fusarium culmorum, при температуре 18 - 21oС, семена соевых бобов, зараженные грибком Phytophtora megasperma, при температуре 20 - 24oС, резаные клубни картофеля, зараженные грибком Fusarium moliniforme, при температуре 20 - 24oС, резаные клубни картофеля, зараженные грибком Fusarium sambusinum, при температуре 20 - 24oС и свеклу, зараженную грибком вида Phoma, при температуре 15 - 19oС. 7. Противогрибковый агент, отличающийся тем, что он представляет собой штамм бактерий Pseudomonas fluorescens NCIB 40186. 8. Противогрибковый агент, отличающийся тем, что он представляет собой штамм бактерий Pseudomonas fluorescens NCIB 40187. 9. Противогрибковый агент, отличающийся тем, что он представляет собой штамм бактерий Pseudomonas fluorescens NCIB 40188. 10. Противогрибковый агент, отличающийся тем, что он представляет собой штамм бактерий Pseudomonas fluorescens NCIB 40190. 11. Сельскохозяйственная противогрибковая композиция, содержащая противогрибковый агент и приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве противогрибкового агента она содержит один из штаммов бактерий Pseudomonas fluorescens NCIB 40186, 40187, 40188 или 40190. 12. Способ ингибирования грибкового поражения растений, предусматривающий обработку растений противогрибковым агентом, отличающийся тем, что в качестве противогрибкового агента используют один из штаммов бактерий Pseudomonas fluorescens NCIB 40186, 40187, 40188, 40190 или композицию, содержащую один из указанных штаммов бактерий.Популярные патенты: 2065260 Гидравлическая система самоходной сельскохозяйственной машины ... штока. Осуществление заднего хода машины возможно только после разблокировки педали 13, а это, в свою очередь, может произойти только после обязательного подъема всех рабочих органов машины. При этом последовательность подачи команд на подъем рабочих органов не имеет значения. Например, перемещая рукоятку секций 38 в положение "ПОДЪЕМ" оператор направляет масло в бесштоковую (поршневую) полость гидроцилиндра 7 - происходит подъем копирующих щупов 4. Одновременно масло через УОК 23 поступает по магистрали 17 в штоковую полость блокировочного сервоцилиндра 15 и через РК 29 под поршень УОК 19 открывает его, но поршень сервоцилиндра при этом не перемещается, т.к. слив масла из ... 2265314 Устройство системы зашторивания теплиц с регулируемым ходом ... сделать длину штанги равной длине одного пролета, с небольшим превышением для размещения крайнего упора. Такое взаимодействие элементов не требует дополнительной мощности привода.На фиг.1 изображен фрагмент системы зашторивания теплицы в плане.На фиг.2 изображен разрез по основным штангам системы зашторивания теплицы.На фиг.3 изображен разрез по дополнительным штангам системы зашторивания уменьшенного пролета теплицы.На фиг.4 изображено исполнение узла поводка с роликами.Система зашторивания теплицы содержит привод, например реечные редукторы 1, с которыми соединены основные штанги 2, установленные в направляющих 5 с возможностью поступательного движения и несущие на себе ... 2452165 Высевающий аппарат зерновой сеялки с централизованным дозированием семян ... высева при уклонах как в продольной, так и в поперечной плоскостях. Раскрытие изобретенияТехнический результат, который может быть достигнут с помощью предлагаемого изобретения, сводится к исключению механических толкающих и крошащих воздействий на семена, снижению их повреждаемости. Семена свободно перемещаются вдоль оси за счет сил гравитации с использованием винтовой поверхности.Технический результат достигается тем, что высевающий аппарат зерновой сеялки включает приемные камеры с загрузочными окнами, соединенными с бункером для семян. Дозирующее устройство состоит из закрепленных на приводном валу двух пар цилиндров, при этом между внутренним и внешним цилиндрами пары ... 2073513 Способ профилактики технологических стрессов молодняка крупного рогатого скота ... республики Башкортостан. Пример 1. Для опыта по принципу аналогов было подобрано 150 бычков 0,5-месячного возраста и 25 бычков 14,5 месячного возраста бестужевской породы, из которых сформировали 35 групп по 5 голов в каждой. Различие между группами заключалось в том, что бычкам опытных групп к основному рациону дополнительно скармливали антиоксидант дилудин в дозах: 6; 12; 18; 24 мг/кг живой массы в течение 5-7 суток до и после стресса при выращивании и откорме и в течение 5-7-суток до транспортировки убойных бычков на мясокомбинат. Результаты проведенного опыта позволили идентифицировать стресс-факторы по силе их воздействия на организм, последующую мясную продуктивность молодняка ... 2092004 Композиционный состав для обработки растений и их органов ... состав для обработки растений и их органов отвечает критерию "новизна", поскольку авторам неизвестно указанное сочетание компонентов состава, а также является новым их массовое содержание в составе. При полном наборе компонентов состава проявляется синергизм его действия, что подтверждается данными опытов (повышение урожайности ячменя на 16-19%). Предлагаемый композиционный состав отвечает критерию "изобретательский уровень", т. к. в заявке показана возможность образования на обрабатываемой поверхности композиционного покрытия, обладающего новыми физико-механическими свойствами, что подтверждается эффектом синергизма пленки в процессе ее эксплуатации в течение периода вегетации ... |
Еще из этого раздела: 2028749 Капустоуборочная машина 2470922 Сокристаллы 2056743 Установка для выращивания пушных зверей 2125366 Доильный аппарат 2159526 Устройство для навешивания сельскохозяйственных орудий на трактор 2473735 Электрический рыбозаградитель направляющего действия (варианты) 2302109 Способ снижения уровня никеля и свинца в крови и молоке коров техногенной провинции 2038763 Регулятор вакуума 2053661 Устройство для сколачивания ульевых рамок 2060618 Пневматический высевающий аппарат |
Изобретения в сельском хозяйстве
Обработка почвы в сельском и лесном хозяйствах
Посадка, посев, удобрение
Уборка урожая, жатва
Обработка и хранение продуктов полеводства и садоводства
Садоводство, разведение овощей, цветов, риса, фруктов, винограда, лесное хозяйство
Новые виды растений или способы их выращивания
Производство молочных продуктов
Животноводство, разведение и содержание птицы, рыбы, насекомых, рыбоводство, рыболовство
Поимка, отлов или отпугивание животных
Консервирование туш животных, или растений или их частей
Биоцидная, репеллентная, аттрактантная или регулирующая рост растений активность химических соединений или препаратов
Хлебопекарные печи, машины и прочее оборудование для хлебопечения
Машины или оборудование для приготовления или обработки теста
Обработка муки или теста для выпечки, способы выпечки, мучные изделия
|
|
||