Способ консервирования интактных клеток печениПатент на изобретение №: 2073435 Автор: Гладских Л.В., Уша Б.В., Беляков И.М., Панин А.Н., Опарин Ю.Г., Бруслик В.Г. Патентообладатель: Московская государственная академия прикладной биотехнологии Дата публикации: 20 Февраля, 1997 Адрес для переписки: подача заявки30.04.1993 публикация патента20.02.1997 Изображения Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к приготовлению культуры клеток. Цель способа - замена печени человека на печень собаки и свиньи при приготовлении культуры клеток гепатоцитов, повышение жизнеспособности интактных клеток печени и увеличение их срока хранения при сохранении высокой жизнеспособности. Способ консервирования интактных клеток печени заключается в заборе печени свиней и собак, проведении сосудистой перфузии печени раствором Хенкса с последующим введением ферментного раствора, содержащего 200-300 мг гиалуронидазы и 10-20 г коллагеназы в 1 л раствора Хенкса. После этого печень погружают в ферментный раствор указанного состава, выдерживают в нем, освобождают печень от капсулы, выдерживают печень в ферментном растворе при постоянном его перемешивании и оксигенации, извлекают печень из раствора, механически разрушают ее ткань, выдерживают клетки печени при температуре 37oC с дальнейшим фильтрованием. Добавляют к фильтрату раствор Хенкса с последующим центрифугированием. Сливают надосадочную жидкость и добавляют повторно раствор Хенкса, центрифугируют и осадок переносят в емкости, смешивая со средой 199 в соотношении 2:1, объемом 1-2 куб. см. Замораживают при минус 50oC в течение 3-4 часов под вакуумом 50-100 мк. рт. ст. с температурой сублимации минус 30oCминус 20oC и температурой досушивания плюс 25oC. 1 табл. ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУИзобретение относится к области биотехнологии, а именно к приготовлению культуры клеток. Известен способ консервирования интактных клеток аллогенной печени, включающий отбор материала, сосудистую перфузию печени раствором Хенкса с последующим введением ферментного раствора, содержащего раствор Хенкса с введением в него гиалуронидазы и коллагеназы, освобождение печени от капсулы, выдерживание печени при полном погружении в ферментный раствор при постоянном его перемешивании и оксигенации, слитии раствора, механическое разрушение ткани печени, выдерживание полученной массы клеток печени при плюс 37 градусах С с дальнейшим фильтрованием, прибавление к полученному фильтрату раствора Хенкса, центрифугировании полученной взвеси, слитии надосадочной жидкости, промывки осадка раствором Хенкса, повторное центрифугирование и декантирование надосадочной жидкости, расфасовывание осадка гепатоцитов с добавлением среды 199 с последующим их консервированием введением актибиотиков. Задачей способа является замена печени человека на печень собаки и свиньи, повышение жизнеспособности интактных клеток печени и увеличение их срока хранения при сохранении высокой жизнеспособности. Сущность способа заключается в том, что у клинически эдоровых свиней и собак после убоя забирают печень, проводят сосудистую перфузию печени раствором Хенкса с последующим введением ферментного раствора, содержащего 200-300 мг гиалуронидазы и 10-20 г коллагеназы в 1 л раствора Хенкса, печень погружают в ферментный раствор концентрацией гиалуронидазы 200-300 мг и коллагеназы 10-20 г/л раствора Хенкса, освобождают печень от капсулы, выдерживают печень в ферментном растворе при постоянном его перемешивании и оксигенации, извлекают печень из ферментного раствора и механически разрушают ее ткань; выдерживают клетки печени при температуре 37oC с дальнейшим фильтрованием. Добавляют к фильтрату раствор Хенкса с последующим центрифугированием. Сливают надосадочную жидкость и добавляют к осадку раствор Хенкса, центрифугируют взвесь и сливают надосадочную жидкость. Добавляют в осадок клеток печени среду 199 в соотношении 2:1, расфасовывают в емкости объемом 1-2 куб.см, замораживают при минус 50 градусов Цельсия в течение 3-4 часов с последующей сублимационной сушкой в течение 20-48 часов под вакуумом 50-100 мк. рт. ст. с температурой сублимации минус 30oCминус 20oC и температурой досушивания плюс 25oC. Способ иллюстриpуется следующими примерами. Пример 1. Забирают печень от клинически здоровых свиней. Через воротную вену печени вводят 6 л раствора Хенкса под давлением до соломенно-желтого цвета самой печени. После этого через воротную вену печени вводят 1 л ферментного раствора, приготовленного растворением 200 мг гиалуронидазы и 10 г коллагеназы в 1 л раствора Хенкса, с температурой 37oC и рН 7,45-7,5 до вздутия органа. Печень помещают на 10 минут в 5 л ферментного раствора указанного состава при температуре 37oC так, чтобы она погрузилась целиком, при этом раствор перемешивают и прокачивают через него кислород. Вынимают печень и механически отделяют от нее капсулу. Печень вновь помещают в 5 л ферментного раствора указанного состава при 37oC с постоянным перемешиванием и оксигенацией раствора на 15 минут. Вынимают печень из раствора и проводят тонкое измельчение ткани, полученную массу клеток выдерживают в термостате при 37oC в течение 10 минут, фильтруют, после чего к фильтрату добавляют раствор Хенкса и вновь фильтруют через 4 слоя нейлонового фильтра с диаметром пор 40 микрон. Добавляют к фильтрату равное количество раствора Хенкса и полученную взвесь центрифугируют при скорости 1000 оборотов в минуту в течение 4 минут, сливают надосадочную жидкость. Осадок промывают раствором Хенкса и вновь проводят центрифугирование. 2 куб.см осадка гепатоцитов смешивают с 1 куб.см среды 199 и расфасовывают по 2 куб.см в ампулы. Направляют на замораживание на кельвинаторе при температуре минус 50oC в течение 4-х часов с последующей сублимационной сушкой в течение 40 часов под вакуумом 50 мк.рт.ст. с температурой сублимации минус 30oC и температурой досушивания плюс 25oC на установке фирмы Лейбольт (ФРГ) аппарата G-T-2. Пример 2. Забирают печень от клинически здоровых собак. Через воротную вену печени вводят 6 л раствора Хенкса под давлением до соломенно-желтого цвета самой печени. После этого через воротную вену печени вводят 1 л ферментного раствора, приготовленного растворением 200 мг гиалуронидазы и 10 г коллагеназы в 1 л раствора Хенкса, с температурой 37oC и рН 7,45-7,5 до вздутия органа. Печень помещают на 10 минут в 5 л ферментного раствора указанного состава при температуре 37oC так, чтобы она погрузилась целиком. При этом раствор перемешивают и прокачивают через него кислород. Вынимают печень и механически отделяют от нее капсулу. Печень вновь помещают в 5 л ферментного раствора указанного состава при 37oC с постоянным перемешиванием и оксигенацией раствора на 15 минут. Вынимают печень из раствора и проводят тонкое измельчение ткани. Полученную массу клеток выдерживают в термостате при 37oC в течение 10 минут. К фильтрату добавляют раствор Хенкса и вновь фильтруют через 4 слоя нейлонового фильтра с диаметром пор 40 микрон. Добавляют к фильтрату равное количество раствора Хенкса и полученную взвесь центрифугируют при скорости 1000 оборотов в минуту в течение 4 минут, сливают надосадочную жидкость. Осадок промывают раствором Хенкса и вновь проводят центрифугирование. 2 куб.см осадка гепатоцитов смешивают с 1 куб.см среды 199 и расфасовывают по 2 куб.см в ампулы. Направляют на замораживание на кельвинаторе при температуре минус 50oC в течение 4-х часов с последующей сублимационной сушкой в течение 48 часов под вакуумом 50 мк.рт.ст. с температурой сублимации минус 30oC и температурой досушивания плюс 25oC, на установке фирмы Лейбольт (ФРГ) аппарата G-T-2. Пример 3. Забирают печень от клинически здоровых свиней. Через воротную вену печени вводят под давлением раствор Хенкса до соломенно-желтого цвета органа. После этого через воротную вену печени вводят ферментный раствор, содержащий гиалуронидазу в концентрации 300 мг и коллагеназу в концентрации 20 г в 1 л раствора Хенкса, до вздутия органа. Печень помещают на 10 минут в ферментный раствор указанного состава при полном погружении в него органа. Вынимают печень и механически отделяют от нее капсулу. Печень вновь помещают в ферментный раствор указанного состава и оставляют в нем на 15 минут. Все операции ферментной деструкции печени осуществляют при 37oC с постоянным перемешиванием и оксигенацией раствора. Вынимают печень из раствора и проводят тонкое измельчение ткани печени. Полученную массу клеток печени выдерживают при температуре +37oC в течение 10 минут, фильтруют. К фильтрату добавляют равное количество р-ра Хенкса, фильтруют взвесь через 4 слоя нейлонового фильтра с диаметром пор 40 микрон. Добавляют к фильтрату равное количество раствора Хенкса и полученную взвесь центрифугируют при скорости 1000 оборотов в минуту в течение 4 минут, сливают надосадочную жидкость. Осадок промывают раствором Хенкса и вновь центрифугируют взвесь. Сливают надосадочную жидкость и добавляют к осадку гепатоцитов среду 199 в соотношении 2: 1. Расфасовывают смесь в ампулу по 1 куб.см. Затем проводят замораживание на кельвинаторе в течение 3-х часов, после чего сублимационную сушку ведут в течение 20 часов под вакуумом 50 мкм рт.ст. и при температуре минус 20oC и последующим досушиванием при плюс 25oC на установке фирмы Лейбольт (ФРГ) аппарата G-T-2. Пример 4. Забирают печень от клинически здоровых свиней. Через воротную вену печени вводят под давлением раствор Хенкса до соломенно-желтого цвета органа. После этого через воротную вену печени вводят ферментный раствор, содержащий гиалуронидазу в концентрации 300 мг и коллагеназу в концентрации 20 г в 1 л р-ре Хенкса, до вздутия органа. Печень помещают на 10 минут в ферментный раствор указанного состава при полном погружении в него органа. Вынимают печень и механически отделяют от нее капсулу. Печень вновь помещают в ферментный раствор указанного состава и оставляют в нем на 15 минут. Все операции ферментной деструкции печени осуществляют при 37oC с постоянным перемешиванием и оксигенацией раствора. Вынимают печень из раствора и проводят тонкое измельчение ткани печени. Полученную массу клеток печени выдерживают при температуре +37oC в течение 10 минут, фильтруют. К фильтрату добавляют равное количество раствора Хенкса, фильтруют взвесь через 4 слоя нейлонового фильтра с диаметром пор 40 микрон. Добавляют к фильтрату равное количество раствора Хенкса и полученную взвесь центрифугируют при скорости 1000 оборотов в минуту в течение 4 минут, сливают надосадочную жидкость. Осадок промывают раствором Хенкса и вновь центрифугируют взвесь. Сливают надосадочную жидкость и добавляют к осадку гепатоцитов среду 199 в соотношении 2:1. Расфасовывают смесь в ампулы по 1 куб.см. Затем проводят замораживание на кельвинаторе в течение 3-х часов после чего сублимационную сушку ведут в течение 24 часов под вакуумом 100 мк.рт.ст. и при температуре минус 20oC с последующим досушиванием при плюс 25oC на установке фирмы Лейбольта (ФРГ) аппарата G-T-2. В результате проведенных экспериментов установлено, что только при использовании ферментного состава, содержащего 200-300 мг/л гиалуронидазы и 10-20 г/л коллагеназы в 1 л раствора Хенкса дает наилучший результат по жизнеспособности гепатоцитов и максимальное увеличение срока хранения препарата без изменения свойств гепатоцита. При обработке ферментным препаратом, содержащим количество ферментов менее 200 мг/л гиалуронидазы и 10 г/л коллагеназы в 1 л раствора Хенкса, приводит к резкому уменьшению количества выделенных изолированных клеток и к увеличению интервала времени на процесс выделения. Концентрация гиалуронидазы свыше 300 мг/л и коллагеназы более 20 г/л в 1 л раствора Хенкса губительно действует на клетки печени свиней и собак, снижая их жизнеспособность в результате сильного ферментативного действия препаратов на клетки гепатоцитов свиней и собак. Препарат интактных клеток печени, полученный по осуществленному способу характеризуется следующим (см. таблицу) Жизнеспособность клеток печени определялась методом окраски гепатоцитов 0,2 раствором трипанового синего с последующим микроскопированием живыми считались "светлые клетки", погибшими "темные". Для определения жизнеспособности гепатоцитов консервированного препарата интактных клеток гепатоцитов, его восстанавливали в среде 199. Соотношение смешивания клеток печени и среды 199 2:1 является экспериментально подобранным. Нарушение этого соотношения приводит к гибели клеток печени свиней и собак при последующей обработке. Только совокупность признаков: ферментной обработки печени, а именно, концентрация гиалуронидазы 200-300 мг и коллагеназы 10-20 г в 1 л раствора, смешивание гепатоцитов со средой 199 в соотношении 2:1, замораживание объема 1-2 мл смеси при минус 50oC в течение 3-4 часов с последующей сублимационной сушкой в течение 20-48 часов под вакуумом 50-100 мк.рт.ст. и при температуре минус 30oCминус 20oC и досушиванием при плюс 25oC позволяет получить 70-75% жизнеспособных клеток, увеличить срок хранения гепатоцитов до 12 месяцев при сохранении их жизнеспособности до 70% Использование параметров замораживания с последующей сублимационной сушкой позволяет сохранить жизнеспособность клеток на длительное время.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯСпособ консервирования интактных клеток печени, заключащийся в заборе печени, ее перфузии вначале раствором Хенкса, а затем раствором гиалуронидазы и коллагеназы на растворе Хенкса, освобождением печени от капсулы, диспергированием печени с последующим консервированием полученных клеток в емкостях в среде 199, отличающийся тем, что гиалуронидазу используют в концентрации 200 300 мг/л, коллагеназу в концентрации 10 20 г/л раствора Хенкса, перед освобождением от капсулы печень дополнительно погружают в раствор Хенкса, содержащий 200 300 мг/л гиалуронидазы и 10 20 г/л коллагеназы, для консервирования среду 199 берут в соотношении клетки печени среда 199 2 1, а затем проводят замораживание 1 2 мл смеси на одну емкость при (-50)oC в течение 3 4 ч, после чего сублимационную сушку в течение 20 48 ч под вакуумом 50 100 мм рт.ст. и при температуре (-30) 20oC с последующим досушиванием при 25oС.Популярные патенты: 2141756 Способ многоуровневого культивирования растений и устройство для его осуществления ... растений, показанного на фиг. 1, в котором следующие две грядки для культивирования помещены на первое поддерживающее средство в соответствии с тем, как это показано на фиг. 2; фиг. 4 - схематический вид в перспективе второго варианта осуществления устройства для многоуровневого культивирования растений в соответствии с данным изобретением; и фиг. 5 - частичный вид в поперечном разрезе, показывающий систему дренажа, используемую в устройстве для многоуровневого культивирования растений, показанном на фиг. 4. Со ссылками на чертежи, в которых одинаковые символы обозначают одинаковые или соответствующие части по нескольким видам и, следовательно, повторное описание не будет ... 2420949 Способ оценки потенциальной урожайности семянок сафлора красильного ... Опубл. 10.11.2000). К недостаткам описанного способа прогнозирования применительно к оценке урожая зерна, например сафлора красильного перспективных сортов, относятся то, что предложенное выражение не учитывает целого ряда существенных факторов, влияющих на качество и величину урожая. Используя ранее приведенные числовые данные для мая (х=16,5°С), т.к. в силу биологии растений, например, сои, в апреле ее не высевают, и приняв величину d=1 и d=0, имеем: у1=51,41-2,13·16,4+10,3·1=26,776 ц/га=2,667 т/га;у2=51,41-2,13·16,4+10,3·0=16,642 ц/га=1,664 т/га.Указанный интервал урожая зерна сои не реален, а сами числовые данные не обеспечивают достоверность ... 2121258 Устройство для вентилирования зерна или другого сыпучего материала (варианты) ... из газопроводов четных рядов 6 поступает в отводящую камеру 2 через расположенные в ней отверстия в открытых торцах названных газопроводов. Во втором примере, когда отводящая камера 2 находится выше подводящей 3 (фиг.8, стенка 9 показана штриховой линией), движение вентилирующего воздуха между камерами 3, 4 и соединенными с ними газопроводами рядов 6 и 7 происходит аналогично рассмотренному в первом примере. Для обратной продувки зерна в каждой емкости 1 положения перекидных клапанов 17 в тройниках 16, 18 и 22, а также дверей 19 камер 2 и 3 (фиг.1-8), изменяют на противоположные. После этого подводящей станет камера 2, а отводящей - 3. Короб 21 и перфорированное дно 20 ... 2229127 Способ испытания растущих деревьев после рубок прореживания и проходных ... строения и свойств древесины каждого керна с учетом поправок, отличающийся тем, что закладку пробной площади шириной не менее 20 м выполняют от края лесной дороги, на пробной площади размечают параллельные лесной дороге ленты шириной не менее 10 м и количеством не менее 5 шт., на которых сосчитывают оставленные после рубок ухода деревья и пни, измеряют расстояния между ними и другие таксационные показатели у деревьев, затем проводят анализ распределения значений таксационных показателей деревьев выявлением эмпирических зависимостей по лентам, начиная от края лесной дороги, а из худших по качеству деревьев выполняют взятие кернов древесины.2. Способ испытания растущих деревьев ... 2459398 Способ рекультивации почв, загрязненных минерализованными водами ... до полной влагоемкости. Рекультивацию проводили в течение 120 суток на открытом воздухе, отбор проб осуществляли каждые 30 суток. Результаты представлены на фиг.3.Как видно из фиг.3, использование данной технологии позволяет за 120 суток рекультивации достичь уровня ПДК для хлорид-ионов. Таким образом, предлагаемая технология является эффективной для рекультивации минерализованных почв. Формула изобретения 1. Способ рекультивации почв, загрязненных минерализованными водами, включающий интенсивное рыхление, внесение сорбента, химмелиоранта, интенсивный полив дождеванием и высадку растительных культур, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют сухие запрессованные ... |
Еще из этого раздела: 2121263 Способ лесоводственной оценки технологического комплекса машин 2164741 Устройство для заготовки древесины 2278509 Брудер для обогрева сельскохозяйственных животных 2440712 Автоматизированная система для хранения в поле, возможности оперативного контроля и выгрузки убранных продуктов урожая из уборочной машины 2247490 Способ освоения закустаренных земель и устройство для его осуществления 2158069 Способ повышения урожайности сельскохозяйственных культур 2201244 Препарат для защиты животных и растений 2217912 Способ проведения контрольного лова молоди пелагических рыб, в частности лососевых, и обкидной невод 2270554 Сепарирующее устройство зерноуборочного комбайна (варианты) 2159030 Способ широкорядного посева пропашных культур |
Изобретения в сельском хозяйстве
Обработка почвы в сельском и лесном хозяйствах
Посадка, посев, удобрение
Уборка урожая, жатва
Обработка и хранение продуктов полеводства и садоводства
Садоводство, разведение овощей, цветов, риса, фруктов, винограда, лесное хозяйство
Новые виды растений или способы их выращивания
Производство молочных продуктов
Животноводство, разведение и содержание птицы, рыбы, насекомых, рыбоводство, рыболовство
Поимка, отлов или отпугивание животных
Консервирование туш животных, или растений или их частей
Биоцидная, репеллентная, аттрактантная или регулирующая рост растений активность химических соединений или препаратов
Хлебопекарные печи, машины и прочее оборудование для хлебопечения
Машины или оборудование для приготовления или обработки теста
Обработка муки или теста для выпечки, способы выпечки, мучные изделия
|
|
||