Штамм panax ginseng c.a.mey - продуцент гинзенозидов и способ получения гинзенозидовПатент на изобретение №: 2067819 Автор: Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н., Козыренко М.М., Рысева И.Н. Патентообладатель: Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения РАН Дата публикации: 20 Октября, 1996 Адрес для переписки: подача заявки21.10.1993 публикация патента20.10.1996 Изображения  Использование: биотехнология. Сущность изобретения: получен штамм клеток Panax ginsing C.A. Mey ВС КК-ВР N 41 - продуцент гинзенозидов. Способ получения гинзенозидов заключается в культивировании на питательной среде указанного штамма и выделении целевого продукта. При этом питательная среда содержит нитраты аммония 350 - 450 мг/л и дополнительно в нее вводят тиамин гидрохлорид 0,15 - 0,25 мг/л, пиридоксина гидрохлорид 0,45 - 0,55 мг/л, никотиновую кислоту 0,45 - 0,55 мг/л, мезо-инозит 80 - 100 мг/л, казеина гидролизат 80 - 120 мг/л и 4-хлорфеноксиуксусную кислоту 0,35 - 0,45 мг/л. 2 с.п. ф-лы, 4 табл. , ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине, парфюмерной, косметической и пищевой промышленности. Известны штаммы женьшеня настоящего Panax ginseng C.A. Mey ИФРЖ1, ИФРЖ2, ИФРЖ3 продуценты биологически активных веществ женьшеня - панаксозидов (гинзенозидов). Известны способы получения панаксозидов путем культивирования штаммов - продуцентов на питательных средах. Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения панаксозидов путем выращивания штамма ИФРЖ1 на питательной среде следующего состава, мг/л воды: NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2 2H2O 440 MgSO4 7H2O 370 KH2PO4 170 H3BO3 6,20 MnSO4 4H2O 22,80 ZNSO4 7H2O 8,60 KJ 0,83 Na2MoO4 2H2O 0,25 CuSO4 5H2O 0,025 CoCl2 6H2O 0,025 FeSO4 7H2O 27,80 Na2 ЭДТА (натриевая соль этилендиаминтетра, уксусной кислоты) 37,30 Тиаминбромид (B1) 0,40  -нафтилуксусная кислота (НУК) 2,0 Кинетин 1,0 Инозит 80 Гидролизат казеина 500 Сахароза 30000 Агар-агар 7000 (Сведения приведены в а. с. N 1058281, кл. C 12 N 5/00. Штамм Panax ginseng ИФРЖ2 продуцент биологически активных веществ и способ получения биологически активных веществ. Р.Г. Бутенко, Н.А. Мясоедов, З.Б. Шамина, Л. И. Слепян. Приоритет от 04.01.82; а.с. N 1058282, кл. C 12 N 5/00. Штамм Panax ginseng ИФРЖ3 процент биологически активных веществ и способ получения биологически активных веществ. Р.Г. Бутенко, Н.А. Мясоедов, З.Б. Шамина, Л. И.Слепян. Приоритет от 04.01.82). Однако известные технические решения не позволяют определить качественный и количественный состав продуцируемых гинзенозидов. Заявляется способ получения гинзенозидов, включающий выращивание штамма-продуцента на питательной среде, содержащей микро- и макросоли, стимуляторы роста, сахарозу и агар, с последующим выделением целевого продукта, в котором в качестве штамма-продуцента используют штамм 1c Panax ginseng C.A. Mey, а выращивание ведут на среде, содержащей, мг/л воды: NH4NO3 350 450 KNO3 1500 2300 CaCl2 2H2O 400 800 MgSO4 7H2O 350 400 KH2PO4 150 190 H3BO3 4,2 8,0 MnSO4 4H2O 15,6 26,7 CoCl2 2H2O 0,02 0,03 CuSO4 5H2O 0,02 0,03 ZnSO4 7H2O 6,0 10,3 Na2MoO4 2H2O 0,20 0,30 KJ 0,53 0,9 FeSO4 7H2O 25,0 30,6 Na2EDTA 2H2O 33,6 41,0 Тиамина гидрохлорид 0,15 0,25 Пиридоксина гидрохлорид 0,45 0,55 Никотиновая кислота 0,45 0,55 Мезо-инозит 80 120 Казеина гидролизат 80 120 4-хлорфеноксиуксусная кислота (4-СРА) 0,35 0,45 Сахароза 23000 27000 Агар 5800 6200 Штамм 1c Panax ginseng C.A. Mey продуцент гинзенозидов получен и депонирован во Всесоюзную коллекцию клеток высших растений ВСКК (ВР) при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева АН СССР под коллекционным номером 41. Наименование штамма 1c. Штамм 1с характеризуется следующими признаками. Описание исходного материала. Исходным материалом для получения штамма 1с были стебли проростков семян женьшеня настоящего Panax ginseng C.A. Mey двухмесячного возраста сорта "Мимаки". Культуральные свойства. Растущая каллусная культура представляет собой ткань рыхлой консистенции светло-желтого цвета без запаха. Ростовой индекс 10 для каллусов начальной массой 100 мг, содержание сухого вещества 4,9% Живых клеток 89 94% в середине экспоненциальной фазы роста. Штамм 1с выращивают при температуре 24  1oC, относительной влажности воздуха 60 10% освещенность отсутствует. Сосуды для выращивания колбы Эрленмейера емк. 100 мл, содержащие 40 мл питательной среды. Состав агаризованной среды, мг/л воды: NH4NO3 350 450 KNO3 1500 2300 CaCl2 2H2O 400 480 MgSO4 7H2O 350 400 KH2PO4 150 190 H3BO3 4,2 8,0 MnSO4 4H2O 15,6 26,7 CoCl2 2H2O 0,02 0,03 CuSO4 5H2O 0,02 0,03 ZnSO4 7H2O 6,0 10,3 Na2MoO4 2H2O 0,20 0,30 KJ 0,53 0,90 FeSO4 7H2O 25,0 30,6 Na2EDTA 2H2 33,6 41,0 Тиамина гидрохлорид 0,15 0,25 Пиридоксина гидрохлорид 0,45 0,55 Никотиновая кислота 0,45 0,55 Мезо-инозит 80 120 Казеина гидролизат 80 120 4-хлорфеноксиуксусная кислота (4-СРА) 0,35 0,45 Сахароза 23000 27000 Агар 5800 6200 pH среды до автоклавирования 5,6 5,88 Продолжительность цикла выращивания 30 суток. Номер пассажа 23. Цитологические и кариологические характеристики штамма 1с. Ткань представляет гетерогенную популяцию, состоящую на 76 88% из клеток меристематического типа круглой или овальной формы, имеющих средние размеры 63 77 мкм, и из клеток паренхимного типа размером 213 267 мкм, содержание в популяции 12 24% Кривая митотической активности имеет одновершинный характер с максимумом на 14 день культивирования. Распределение клеток по числу хромосом, клеток в модальном классе, приведено в табл. 1. Способность к морфогенезу. В культуре наблюдается редко спонтанный ризогенез при увеличении продолжительности культивирования в одном пассаже для полутора двух месяцев. Характеристика биосинтеза гинзенозидов. Штамм 1с продуцирует гинзенозиды гликозиды даммарановой группы Rg1, Re, Rf, NG-R2, Rg2, Rb1, Rc, Rb2, Rd. Максимальное накопление гинзенозидов наблюдается на 30 сутки культивирования. Общее содержание гинзенозидов (Rg1, Re, Rf, NG-R2, Rg2, Rb1, Rc, Rb2, Rd) в каллусах штамма 1с составляет 8,1 1,1 мг/г сухой массы. Выхода гинзенозидов в среду культивирования не наблюдается. Штамм 1с продуцирует гинзенозиды в количествах, сравнимых с их содержанием в корнях плантационных растений (табл. 2). Культура продуцирует редкие гинзенозиды Rg2 и NG-R2, характеризуется стабильными соотношениями Rb-группа/Rg-группа 0,12 0,17 Гликозид Re/гликозид Rg1 1,4 1,7 Использование штамма 1с в качестве продуцента гинзенозидов и способ получения гинзенозидов иллюстрируется следующим примером. В колбы Эрленмейера емкостью 100 мл наливают по 40 мл питательной среды следующего состава, мг/л воды: NH4NO3 400 KNO3 1900 CaCl2 2H2O 440 MgSO4 7H2O 370 KH2PO4 170 H3BO3 6,2 MnSO4 4H2O 22,3 CoCl2 2H2O 0,025 CuSO4 5H2O 0,025 ZnSO4 7H2O 8,6 Na2MoO4 2H2O 0,25 KJ 0,83 FeSO4 7H2 27,8 Na2EDTA 2H2 37,3 Тиамина гидрохлорид 0,2 Пиридоксина гидрохлорид 0,5 Никотиновая кислота 0,5 Мезо-инозит 100 Казеина гидролизат 100 4-хлорофеноксиуксусная кислота (4-СРА) 0,4 Сахароза 25000 Агар 6000 pH среды 5,60 Колбы со средой автоклавируют при температуре 117oC в течение 20 мин, затем охлаждали. В асептических условиях в каждую колбу помещают по 100 мг клеточной биомассы штамма 1с. Культивирование проводят в темноте при 24oC и относительной влажности воздуха 60% в течение 30 суток. В каждой колбе накапливается от 1 до 1,5 г сырой биомассы. После лиофильной сушки каллусов в них определяют содержание гинзенозидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) масс-спектроскопии. Выделение суммарной гликозидной фракции. Один грамм измельченной лиофильно высушенной ткани экстрагируют трижды 85% водным метанолом при перемешивании. Объединенный раствор упаривают досуха при 50oC на роторном испарителе. Осадок после испарения экстрагируют пентаном (5 мл х 2) и насыщенным водой н-бутанолом (5 мл х 3). Промытый 5 мл воды бутанольный экстракт при тех же условиях упаривают до сухого остатка, который и составляет суммарную гликозидную фракцию (СГФ). Анализ ВЭЖХ. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии анализируют раствор СГФ концентрацией 10 30 мг/мл. Разделение проводят на хроматографе "Милихром" со стальной колонкой 64х2 мм, заполненной сорбентом Spherisorb ODS 5 мл. На колонку наносят 10 15 мкл раствора СГФ. Элюцию осуществляют градиентом смеси ацето-нитрил вода в соотношении от 20:80 до 50:50 объемных процентов. Детектирование элюата осуществляют при 204 нм. Время разделения 20 мин при скорости подачи растворителя 100 мкл/мин. Значения индексов удерживания индивидуальных гликозидов приведены в табл.3. Анализ масс-спектров. а) Плазменно-десорбционные масс-спектры (ПДМС) с расположением осей источник-мишень-детектор. Активность источника 10 мккюри. На мишень, покрытую нитроцеллюлозной матрицей, наносят 3 мкл метанольного раствора фракций после ВЭЖХ. б) Бомбардировка ускоренными атомами. Эксперименты выполнены на FINIGANN MAT 8030 инструменте с FN11 источником ускоренных атомов, 8 кВ, 1 мкА. На мишень наносят мкл раствора фракции после ВЭЖХ, метанол отгоняют струей теплового воздуха, затем добавляют 1 мкл глицерина и проводят измерения. Получены следующие величины m/z ионов гликозидов, специфических для штамма 1 с: Величины m/z ионов: MNa+793 (M 770) NG-R2; MNa+807 (M 784) Rg2; MNa+1131 (M 1108) Rb1; M-H 769 (M 770) NG-R2; M-H 783 (M 784) Rg2 Содержание гинзенозидов представлено в таблице 4. Таким образом, заявляемым способом, использующим штамм 1с каллусной культуры растений Panax ginseng C.A. Mey продуцент гинзенозидов в количествах, сравнимых с их содержанием в плантационных корнях интактных растений женьшеня настоящего, получен спектр гинзенозидов Rg1, Re, Rf, NG-R2, Rg2, Rb1, Rc, Rb2, Rd, из которых Rg2 и NG-R2 являются редкими. Штамм 1с характеризуется стабильными соотношениями: Rb-группа/Rg-группа 0,12 0,17; Гликозид Re/гликозид Rg1 1,4 1,7.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Штамм культуры клеток Panax ginseng C.A. Mey ВСКК-ВР N 41 продуцент гинзенозидов. 2. Способ получения гинзенозидов путем выращивания штамма-продуцента на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы, стимуляторы роста, сахарозу и агар, и последующего выделения целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм культуры клеток Panax ginseng C. A.Mey ВСКК-ВР N 41, при этом питательная среда содержит нитрат аммония 350 - 450 мг/л и дополнительно в нее вводят тиамин гидрохлорид 0,15 0,25 мг/л, пиридоксина гидрохлорид 0,45 0,55 мг/л, никотиновую кислоту 0,45 0,55 мг/л, мезо-инозит 80 120 мг/л, казеина гидролизат 80 120 мг/л и 4-хлорфеноксиуксусную кислоту 0,35 0,45 мг/л.Популярные патенты: 2175833 Охладитель молока с аккумулятором холода ... времени охлаждения молока за счет использования дополнительно к холоду, вырабатываемому термоэлектрическим блоком при работе в режиме охлаждения молока, холода, аккумулированного льдом с высокой удельной теплотой плавления. В соответствии с данным изобретением разработана рабочая конструкторская документация и ведется изготовление опытного образца охладителя молока с аккумулятором холода. Как показывают расчеты, аккумулятор холода с намораживанием льда, выполненный в соответствии с данным изобретением, по объему в 6 раз меньше, чем такой же аккумулятор, аккумулирующий холод в охлажденной до +1...+2oC воде. ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ 1. Курылев E. С. , Герасимов Н.А. "Холодильные ... 2487516 Почвообрабатывающая машина ... концах тяг выполнены шарниры Кардано или петли из троса, а передние концы тяг связаны с осью, передвигающейся по направляющей в рамном брусе при помощи гидроцилиндра. На вертикальной стойке рамы установлен гидромотор со сдвоенным шкивом для тросов, концы которых соединены с вертикальными рычагами на цапфах рабочих органов.На фиг.1 изображена почвообрабатывающая машина (вид сбоку); на фиг.2 - вид машины сверху; на фиг.3 - вид машины сзади в транспортном положении; на фиг.4 - поперечный разрез рабочего органа машины; на фиг.5 - разрез А-А с фиг.4; на фиг.6 - вид Б привода рабочего органа с фиг.4. Машина состоит из рамы в виде продольного бруса 1, в передней части которого выполнено ... 2262220 Способ возделывания кормовых культур в условиях астраханской области (варианты) ... подавлению сорной растительности. После уборки предшественника проводят лущение стерни на глубину 8-12 см дисковыми лущильниками ЛДГ-10 в агрегате с тракторами класса тяги 3 (ДТ-75, Т-150 и др.). После лущения стерни вносят калийные и фосфорные удобрения.Предшественниками однолетних кормовых культур могут использоваться кормовые культуры, возделываемые на сенаж или зеленый корм. Уборку предшественника проводят не позже третьей декады августа. После уборки предшествующих культур поле (орошаемый участок в кормовом севообороте) обрабатывают дисковыми (реже лемешными) лущильниками. Внесение фосфорных и калийных удобрений осуществляют разбрасывателями минеральных удобрений, ... 2479988 Способ формирования линейно ориентированного виноградника с капельным орошением (версия 3) ... поливной воды в их верхней части, после чего соосно патрубкам вводят в грунт чашеобразный сосуд с герметичной верхней его частью, в котором выполняют вертикальный паз для верхней части патрубка, где его и располагают, при этом верхнюю часть чашеобразного сосуда выполняют в виде вертикальной опоры с цилиндрической верхней частью и с резьбой для последующего свинчивания с вертикальной опорой, которую выполняют также с резьбой и со сквозными ортогональными отверстиями, которые выполняют не меньше диаметра направляющей проволоки и позиционно располагают на соответствующем уровне расположения их, после чего выполняют функциональное соединение вертикальной опоры чашеобразного сосуда и ... 2060659 Установка для переработки органического субстрата в биогумус ... плоскости на горизонтальные шахтообразователи. Это позволяет упростить конструкцию и снизить материалоемкость контейнеров, повысить производительность при загрузке контейнеров, при помощи фронтального загрузчика и засева червей. На фиг. 1 изображена червоводня, вид сверху; на фиг. 3 то же, вид с торцовой стороны; на фиг. 3 устройство для шахтообразования и засева червями питательной среды. Червоводня содержит камеру 1 для приготовления питательной среды, камеру 2 для загрузки питательной среды в контейнеры 3, шахтообразования и засева дождевыми червями, помещение 4 для выращивания дождевых червей, камеру 5 для отделения дождевых червей от среды обитания, камеру 6 для ... |
Еще из этого раздела: 2208312 Способ измерения количества молока в потоке и устройство для его осуществления 2395497 Способ стимулирования роста подсолнечника регулятором роста 2177226 Способ защиты растений от болезней, регулирования их роста и защитно-стимулирующий комплекс для его осуществления 2164741 Устройство для заготовки древесины 2108700 Способ оценки горных сенокосов и пастбищ 2112337 Рабочий орган культиватора 2438305 Способ выращивания цыплят-бройлеров 2399200 Устройство для обработки роговых образований животных, например крупного рогатого скота 2502793 Масло, семена и растения подсолнечника с модифицированным распределением жирных кислот в молекуле триацилглицерина 2432394 Ингибирование образования биогенного сульфида посредством комбинации биоцида и метаболического ингибитора |
Изобретения в сельском хозяйстве
Обработка почвы в сельском и лесном хозяйствах
Посадка, посев, удобрение
Уборка урожая, жатва
Обработка и хранение продуктов полеводства и садоводства
Садоводство, разведение овощей, цветов, риса, фруктов, винограда, лесное хозяйство
Новые виды растений или способы их выращивания
Производство молочных продуктов
Животноводство, разведение и содержание птицы, рыбы, насекомых, рыбоводство, рыболовство
Поимка, отлов или отпугивание животных
Консервирование туш животных, или растений или их частей
Биоцидная, репеллентная, аттрактантная или регулирующая рост растений активность химических соединений или препаратов
Хлебопекарные печи, машины и прочее оборудование для хлебопечения
Машины или оборудование для приготовления или обработки теста
Обработка муки или теста для выпечки, способы выпечки, мучные изделия
|
|
||