Способ введения в культуру клеток льна многолетнегоПатент на изобретение №: 2506741 Автор: Литвинова Илина Игоревна (RU), Гладков Евгений Александрович (RU), Гладкова Ольга Николаевна (RU) Патентообладатель: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный машиностроительный университет (МАМИ)" (RU) Дата публикации: 20 Февраля, 2014 Начало действия патента: 29 Ноября, 2012 Адрес для переписки: 107023, Москва, ул. Б. Семеновская, 38, Университет машиностроения, ОИПС Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой получение каллуса на питательной среде Мурасиге-Скуга, доведенной до 1 литра водой, в течение одного пассажа, где в питательную среду добавляют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту с концентрациями 4-8 мг/л, культивируют семена льна многолетнего, в питательную среду Гамборга добавляют 6-бензиламинопурин с концентрацией 1-2 мг/л и -нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и затем на питательную среду Гамборга пересаживают полученные каллусы для регенерации и культивируют в течение 2-4 пассажей, в жидкую питательную среду Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50% добавляют -нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и на нее пересаживают растения-регенеранты и культивируют их в течение 2-4 пассажей. Изобретение позволяет ввести в культуру клетки льна многолетнего. 3 табл. Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в исследованиях в области физиологии растений, общей и городской экологии. Известны работы по льну-долгунцу, который используется в сельском хозяйстве и в животноводстве, а так же в других отраслях промышленности (Поляков А.В. Биотехнология в селекции льна: Монография. - Тверь, 2000, с.139; Белоногова М.А. Генетическая трансформация льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) с использованием семядольных эксплантов. Автореферат дисс. на соискание уч. ст. канд. биол. наук, Москва, 2006, с.4). Наиболее близким является способ введения в культуру клеток льна, заключающийся в получении каллуса на питательной среде Мурасиге-Скуга, доведенной до 1 литра водой, в течение одного пассажа (Гончарук Е.А., Калашникова Е.А., Дубравина Г.А., Загоскина Н.В. Влияние кадмия на морфологические и биохимические характеристики каллусных клеток чайного растения и льна-долгунца. С.-х. биотехнология. - М.: Воскресенье, Т.2, 2001, с.101). Для получения стерильных проростков использовали семена льна-долгунца (Linum usitatissimum L.). Семена стерилизовали 0,1% раствором сулемы в течение 10-12 мин, промывали в трех порциях стерильной дистиллированной воды, после чего культивировали на питательной среде Мурасиге-Скуга без регуляторов роста. Каллусную культуру получали из сегментов гипокотилей. Для этого гипокотили культивировали на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. Пересадку каллусной ткани осуществляли один раз в месяц. Для регенерации использовали питательную среду Мурасиге-Скуга с добавлением 1 мг/л 6-бензиламинопурина. Однако в известных способах используется другой вид льна - лен-долгунец (Linum usitatissimum L.) и применение этого способа оказалось неэффективным для льна многолетнего (Linum perenne L.). Среди недостатков способа-прототипа можно отметить получение каллусной ткани из сегментов гипокотилей, что затрудняло и увеличивало продолжительность культивирования. На этапах стерилизации семян не использован спирт, соответственно не было проведено обезжиривание семян, что в последующем уменьшает эффективность стерилизующего агента (сулемы). Использование 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты на этапе каллусообразования было неэффективным для льна многолетнего (процент каллусообразования - 9,4%), регенерация на среде Мурасиге-Скуга с 1 мг/л 6-бензиламинопурина была низкой (процент регенерации - 18,4%). Растения льна многолетнего с корневой системой получить не удалось. Задачей метода было разработать способ введения в культуру клеток, регенерации и укоренения растений льна многолетнего. Поставленная задача решается тем, что согласно изобретению на питательную среду Мурасиге-Скуга, доведенной до 1 литра водой, добавляют 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоту с концентрациями 4-8 мг/л, культивируют семена льна многолетнего (Linum perenne L.) в течение одного пассажа, в питательную среду Гамборга добавляют 6-бензиламинопурин с концентрацией 1-2 мг/л и -нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и затем на питательную среду Гамборга пересаживают полученные каллусы для регенерации и культивируют в течение 2-4 пассажей, в жидкую питательную среду Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50% добавляют -нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и на нее пересаживают растения-регенеранты и культивируют их в течение 2-4 пассажей. Таким образом, сущность изобретения состоит в том, что в качестве первичных эксплантов использовали семена льна многолетнего (Linum perenne L.), процесс каллусообразования происходил на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) в концентрациях 4-8 мг/л в течение 1 пассажа, затем регенерация на питательной среде Гамборга с добавлением 6-бензиламинопурина (БАП) с концентрацией 1-2 мг/л и -нафтилуксусной кислоты (НУК) с концентрацией 0,1-0,5 мг/л, в течение 2-4 пассажей, укоренение растений на питательной среде Мурасиге-Скуга, с концентрацией всех компонентов 50%, с добавлением НУК с концентрацией 0,1-0,5 мг/л, в течение 2-4 пассажей. Заявленные пределы определены следующим образом: при концентрации 2,4-Д менее 4 мг/л - процент каллусообразования незначительный и большая часть семян образует побеги; при увеличении концентрации 2,4-Д в питательной среде более 8 мг/л происходит уменьшение каллусообразования и существенное снижение морфогенетической активности в дальнейших пассажах. При концентрации БАП ниже 1 мг/л культивирование каллусов сопровождалось повышенным процессом ризогенеза у каллусных тканей и существенным снижением регенерационной способности; выше 2 мг/л - также происходило существенное снижение регенерационной способности. При концентрации НУК ниже 0,1 мг/л не образовывались морфогенные каллусы; культивирование на среде с 0,5 мг/л НУК сопровождалось снижением регенерационной способностью и повышенным процессом ризогенеза у каллусных тканей. На этапе укоренения на концентрациях выше или ниже 0,1-0,5 мг/л практически не образовывались растения с корневой системой. Изобретение иллюстрируется следующими примерами, результаты по примерам представлены в таблицах. Пример 1 Для введения в культуру клеток льна многолетнего (Linum perenne L.) использовались семена растений. Предварительно семена стерилизовали однократной обработкой спиртом с последующей стерилизацией раствором, содержащим гипохлорит натрия (с содержанием активного хлора 75-95 г/дм3) в течение 15-20 мин. Затем их три раза промывали стерильной дистиллированной водой. Стерилизация семян в растворе, содержащим гипохлорит натрия, менее 15 мин была неэффективной, наблюдалась высокая зараженность семян при культивировании на питательной среде; более 20 мин - семена обесцвечивались и теряли жизнеспособность. Семена культивировали на питательной среде Мурасиге-Скуга видоизмененной добавлением 2,4-Д, каллус получали в течение одного пассажа. Пример 2 Эмбриогенный каллус формировался с высокой частотой на семенах при концентрации 2,4-Д: 4; 6 и 8 мг/л (таблица 1) на питательной среде Мурасиге-Скуга в течение одного пассажа. Таблица 1 Частота каллусообразования (%) льна многолетнего (Linum perenne L.) в зависимости от концентраций 2,4-Д в питательной среде Мурасиге-Скуга Концентрация 2,4-Д, мг/л Частота каллусообразования (%) 19,4±0,6 238,0±2,7 456,8±4,0 663,3±6,5 867,4±8,1 1045,0±3,6Пример 3 Культивирование каллуса на средах с высоким содержанием 2,4-Д (10 мг/л) приводило к существенному снижению способности к морфогенезу. Образовавшиеся каллусы пересаживают на питательную среду Гамборга видоизмененную добавлением БАП - 1-2 мг/л и НУК - 0,1-0,5 мг/л для культивирования морфогенных каллусов и регенерации в течение 2-4 пассажей. При культивировании более 4 пассажей существенно снижалась регенерационная способность, менее 2 пассажей прирост каллусной ткани был незначительный. Полученные регенеранты для укоренения помещали в пробирки на мостики из фильтровальной бумагой, с жидкой питательной средой Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50% видоизмененную добавлением НУК - 0,1-0,5 мг/л. Пример 4 Регенерацию льна многолетнего проводят на питательной среде Гамборга. В качестве фитогормонов используют БАП (1-2 мг/л) и НУК (0,1-0,5 мг/л). Использование среды Мурасиге-Скуга было менее эффективным, так как процент морфогенных каллусов был ниже, чем на среде Гамборга. Например, при концентрации 1 мг/л БАЛ и 0,1 мг/л НУК максимальный процент морфогенных каллусов на среде Гамборга составлял 63,5%, а на среде Мурасиге-Скуга - 42,1% (таблица 2). Таблица 2 Доля каллусов с побегами (%) льна многолетнего (Linum perenne L.) в зависимости от концентраций БАП и НУК в питательной среде Концентрация БАЛ+НУК, мг/л Доля каллусов с побегами (%) на среде Мурасиге-Скуга Доля каллусов с побегами (%) на среде Гамборга 1+018,4±2,1 34,2±3,81+0,1 42,1±2,763,5±4,9 1+0,536,4±3,9 50,8±5,2 1+1,011,2±1,6 14,2±1,62+0,1 32,5±3,746,0±4,5 2+0,524,9±2,8 30,7±2,8 Пример 5 Укоренение проводят на жидкой питательной среды Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50% и видоизмененную добавлением НУК с концентрациями 0,1-0,5 мг/л в течение 2-4 пассажей. При культивировании в течение 1 пассажа корни практически не образовывались, а культивирование более 4 пассажей не приводило к увеличение количества укореняемых растений. Таблица 3 Доля растений-регенерантов с корнями (%) у льна многолетнего (Linum perenne L.) в зависимости от концентраций НУК в жидкой питательной среде Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50%Концентрация НУК, мг/л Доля растений-регенерантов (%) 028,1±1,4 0,163,8±7,2 0,552,4±6,3 136,2±2,9 60 Техническим результатом изобретения является то, что частота каллусообразования составляет от 56,1% до 67,4%, регенерационная способность от 30,7% до 63,5%, укоренение от 52,4% до 63,8%. Результаты изобретения показывают высокую эффективность данного метода, который позволил получить высокий процент регенерации и укоренения растений. Результаты показывают, что данный метод является эффективным, так как каллус образуется с высокой частотой, процент регенерации и укоренения in vitro высокий. Процесс получения растений из семян занимает 7-8 месяцев. Все перечисленное выше позволяют рекомендовать данный метод для введения в культуру клеток льна многолетнего (Linum perenne L.). Поставленная задача достигнута существенным повышением частоты каллусообразования и регенерации льна многолетнего. Формула изобретенияСпособ введения в культуру клеток льна многолетнего, заключающийся в получении каллуса на питательной среде Мурасиге-Скуга, доведенной до 1 литра водой, в течение одного пассажа, отличающийся тем, что в питательную среду добавляют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту с концентрациями 4-8 мг/л, культивируют семена льна многолетнего, в питательную среду Гамборга добавляют 6-бензиламинопурин с концентрацией 1-2 мг/л и -нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и затем на питательную среду Гамборга пересаживают полученные каллусы для регенерации и культивируют в течение 2-4 пассажей, в жидкую питательную среду Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50% добавляют -нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и на нее пересаживают растения-регенеранты и культивируют их в течение 2-4 пассажей. Популярные патенты: 2083070 Способ предпосевной обработки семян и устройство для его осуществления ... из 700 импульсов магнитного поля, в пределах от 30 до 200 кА/м варьируя амплитуду напряженности магнитного поля, при фиксированной длительности импульсов 30 мкс. Результаты представлены в табл. 3. Положительный эффект наблюдается в интервале амплитуд напряженности магнитного поля от 70 до 150 кА/м. При напряженностях ниже 70 кА/м эффект повышения всхожести отсутствует, а при напряженностях выше 150 кА/м происходит подавление всхожести. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ предпосевной обработки семян, включающий обработку семян импульсным магнитным полем, отличающийся тем, что амплитуду напряженности магнитного поля устанавливают 70 150 кА/м, длительность импульсов 10 40 мкс и ... 2076594 Установка для промышленного разведения дождевых червей ... переключение воздухопотоков в каналах 16 и 24, а также подключение к трубам 35 и 36. Кроме того, в системе труб 35 и 36 могут быть установлены вентиляторы (не показаны) для обеспечения необходимого потока воздуха, если естественная тяга не обеспечивает надлежащее проветривание каналов 16 и 24 и таким образом не обеспечивается необходимый тепловой режим. Для подогрева субстрата, находящегося в тоннеле, в канале 16 расположены трубы 39 (фиг.6 и 10), являющиеся контуром теплообменника, отдающего тепло. Трубы 39 подключены к контуру теплообменника 40 (фиг.3,6), установленные в сырье 41 (смесь навоза, растительных остатков и необходимых компонентов для получения субстрата равной ... 2167648 Средство для защиты от укусов кровососущих насекомых (варианты) и способ его получения ... оно легко смывается с кожных покровов либо удаляется естественным путем. Данная задача решается тем, что средство для защиты от укусов кровососущих насекомых, содержащее репеллент насекомых, эмульгатор, стабилизатор эмульсии репеллента и воду, в качестве репеллента содержит предварительно структурно модифицированный ДЭТА в виде полупродукта с показателем динамической вязкости 25oC=0,8-1,6 Пас, полученный путем взаимодействия N, N-диэтил-м-толуамида при температуре 20-70oC с сополимером малеинового ангидрида с виниловым и/или акриловым мономером общей формулы где R1: -H, -CH3, R2: -CmH2m+1, -C6H5, -C6H4CH3, -O-CmH2m+1, -O-CO-CmH2m+1, -CO-O-CmH2m+1, n = 100...60000, m = 1...16. при ... 2189718 Пневматический высевающий аппарат ... расположения высеваемых на различных скоростях семян двух культур. Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является пневматический высевающий аппарат [3, 4], содержащий корпус, разделенную семенную и вакуумную камеры, установленный между ними на горизонтальном валу высевающий диск, состоящий из основания с присасывающими отверстиями, накладки с присасывающими отверстиями, выполненными напротив просасывающих отверстий, и сквозными вырезами-ячеями по всему периметру накладки и прокладки, обеспечивающей получение между основанием и накладкой щели, через которую передается вакуум от просасывающих отверстий основания к присасывающим отверстиям и ячеям ... 2394414 Соединительное устройство для сельскохозяйственной машины ... а часто и экономию времени в процессе конечной сборки. В соответствии с изобретением в соединительном устройстве для сельскохозяйственной машины с по меньшей мере одной инструментальной балкой для почвообрабатывающих инструментов, удлинительная часть конца балки почвообрабатывающих инструментов - семенных сошников, зубцов культиватора по меньшей мере на одной стороне машины закреплена с возможностью отсоединения с помощью соединения болт/гайка, расположенного внутри указанной инструментальной балки. В главной части балки может быть закреплено тело, снабженное по меньшей мере одним резьбовым отверстием, а в удлинительной части балки может быть закреплена контропора, снабженная ... |
Еще из этого раздела: 2400960 Ориентирующее устройство для корнеплодов конической формы 2415529 Нижняя тяга для навески трактора 2384048 Способ испытания травяного покрова на пойме малой реки 2492632 Способ орошения 2165141 Тепличный гидропонный комплекс 2027341 Бункер для сыпучих материалов 2150199 Способ закрепления элемента рыболовной снасти, выполненного с внутренней полостью, к леске 2154629 Производные оксима, способ их получения, фунгицидное средство и способ борьбы с грибковыми заболеваниями 2210910 Способ обработки растений и используемая в нём композиция для защиты растений 2199860 Способ увеличения устойчивости подсолнечника к действию гербицида |