Способ диагностики телэнцефального глиоза у детей с врожденными инфекциями

Изобретение относится к области медицины, а именно инфектологии и патологической анатомии, и может быть использовано для диагностики телэнцефального глиоза (ТГ) у детей с врожденными инфекциями. Способ включает морфологическое исследование ткани головного мозга. Фрагменты ткани белого вещества берут из перивентрикулярных участков мозга на уровне начальных отделов задних рогов боковых желудочков и на уровне межжелудочкового отверстия, гистологические срезы окрашивают иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител к Glial Fibrillary Acidic Protein, выявляют реактивные астроциты и по их наличию в срезе более 30% диагностируют телэнцефальный глиоз. Использование заявленного способа позволяет наиболее точно диагностировать ТГ при врожденных инфекциях у детей и способствует установлению раннего, точного инструментального диагноза. 2 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно инфектологии и патологической анатомии, и может быть использовано для диагностики поражений головного мозга у детей.

Белое вещество головного мозга у новорожденных и детей раннего возраста является очень ранимым, повреждается часто, так как находится в процессе миелинизации и активных обменных процессов. Через белое вещество из субэпендимального матрикса происходит процесс миграции нейронов в кору больших полушарий мозга. Клетки глии находятся в фазе своего созревания и дифференцировки. Особенно часто повреждается белое вещество мозга у недоношенных детей. Наиболее частыми поражениями белого вещества мозга являются перивентрикулярная лейкомаляция (ПВЛ), телэнце-фальный глиоз (ТГ), отечно-геморрагическая энцефалопатия (ОГЛ) и пери-вентрикулярный геморрагический инфаркт. Главным морфологическим признаком ТГ является появление увеличенного количества гипертрофированных астроцитов белого вещества мозга. Данные астроциты называют также пролиферирующими (встречаются астроциты в состоянии деления, двухядерные и трехядерные формы) и реактивными. Синонимами данного поражения мозга у детей являются «перинатальная телэнцефалическая лейкоэн-цефалопатия», «астроглиоз», «глиоз белого вещества мозга» (В.В.Власюк. Патология головного мозга у детей - при инфекциях, гипоксически-ишемических поражениях и пороках развития. СПб.: «Лема», 2012). В настоящее время существуют трудности диагностики ТГ, связанные с выявлением гипертрофированных и реактивных астроцитов, их окрашиванием и с проблемами дифференцировки разнообразных форм астроцитов и глиальных клеток в белом веществе развивающегося мозга детей. Все это затрудняет правильную диагностику ТГ. Существуют проблемы дифференциальной диагностики ТГ с отечно-геморрагической энцефалопатией (ОГЛ), важнейшим критерием различий которых является наличие при ТГ увеличенного количества гипертрофированных и пролиферирующих астроцитов. Гипертрофированные астроциты не всегда четко дифференцируются в детском головном мозге, кроме того, пишут об «остро поврежденных клетках глии» неясного генеза, что затрудняет диагностику ТГ.

Известны способы оценки состояния астроцитарной глии при диагностике ТГ с помощью окраски срезов головного мозга гематоксилином и эозином (Gilles F.H., Murphy S.F. Perinatal teleencephalic leucoencephalopathy. - J. Neurol. Neurosurg. Psychiat., 1969, v.32, p.404-413; Rorke, L.B. Pathology of Perinatal Brain Injury / L.B. Rorke. - New York: Raven Press, 1982. - 146 p.). Берутся кусочки головного мозга без четкой топографической направленности, заливаются в парафин, делаются срезы, окрашиваются гематоксилином и эозином (Г и Э) и изучаются в световом микроскопе. Указывают, что при ТГ кроме гипертрофированных астроцитов обнаруживаются другие патологические изменения белого вещества мозга (амфофильные шарики, остро поврежденные клетки, фокусы некрозов), но они не являются постоянными находками (Gilles F.H., Murphy S.F. Perinatal telencephalic leucoencephalopathy. - J. Neurol. Neurosurg. Psychiat., 1969, v.32, p.404-413; Leviton A., Gilles F.H. Morphologic correlates of age at death as infants with perinatal telencephalic leucoencephalopathy.-Amer. J. Pathol., 1971, v. 65, p.303-310). В результате исследования делается заключение о наличии ТГ (перинатальной телэнцефалической лейкоэнцефалопатии). Однако при окрашивании Г и Э астроциты не всегда четко видны. Авторы указывают на наличие астроцитов небольших размеров, которые нельзя называть гипертрофированными. Авторы выделяют «остро поврежденные клетки глии», в отношении которых нельзя сделать заключение, что они не относятся к астроцитарной глии. То есть при окрашивании Г и Э невозможно точно учесть и подсчитать астроцитарную глию. Кроме того, гипертрофированные астроциты могут появляться и при отечно-геморрагической лейкоэнцефалопатии - другой форме поражения белого вещества мозга. Поэтому диагноз ТГ при описанном подходе не является достаточно точным.

Известны способы диагностики ТГ путем окраски астроцитарной глии по методам Рамон и Кахалю (золото-сулемовый метод) и по Кайзеру [Г.А.Меркулов. Курс патологогистологической техники. Л.: «Медицина», 1969. - С.229-231]. При этих методах кусочки мозга фиксируют в соответствующих растворах сроком до 20 дней, готовят замороженные срезы, импрегнируют золото-сулемовым раствором или раствором серебра и проводят дальнейшее окрашивание. Однако эти способы трудоемки, капризны, требуют больших затрат времени, редких реактивов и в настоящее время почти не применяются. При этих окрасках плохо видны другие структуры мозга, другая глия, ядра клеток. Трудно изготовить качественные микропрепараты.

Наиболее близким к предлагаемому способу является методика В.В. Власюка (Власюк, В.В. Перивентрикулярная лейкомаляция у детей / В.В. Власюк. - СПб.: Геликон Плюс, 2009. - 172 с.) по диагностике ТГ. По этой методике берутся кусочки белого вещества из перивентрикулярных отделов боковых желудочков мозга, заливаются в парафин, делаются гистологические срезы, которые окрашиваются гематоксилином и эозином. При световой микроскопии определяются астроциты различных видов (выделяются 3 вида реактивных астроцитов) и по увеличению их количества по сравнению с нормой диагностируются ТГ. Недостатком данного способа является окрашивание срезов Г и Э, не позволяющего четко дифференцировать астроциты для диагностики ТГ, указаны выше. Этот способ окрашивания не позволяет провести четкие различия между ОГЛ и ТГ. Кроме того, данный способ не всегда позволяет четко провести различия между ТГ и ПВЛ, поскольку вокруг очагов ПВЛ также могут обнаруживаться гипертрофированные (реактивные астроциты), между ТГ и другими поражениями белого вещества мозга. Гипертрофированные астроциты могут обнаруживаться вокруг очагов энцефалита, очагов инфарктов и кист в разных отделах головного мозга. Однако их наличие не является доказательством ТГ как особой формы поражения головного мозга. В описываемом методе нет данных, какие конкретно участки мозга необходимо брать для диагностики ТГ. Способ не обеспечивает точности диагностики.

Недостатками всех перечисленных методов являются следующие: 1) отсутствие четких указаний, где конкретно в перивентрикулярных участках мозга брать кусочки для исследований, 2) окрашивание гистологических срезов гематоксилином и эозином, которое не позволяет четко выявлять астроциты и дифференцировать их от других клеток глии, 3) отсутствие четких критериев по количественной оценке числа астроцитов при ТГ, то есть обнаружение какого количества реактивных астроцитов позволяет делать заключение о наличии у ребенка ТГ.

С целью устранения этих недостатков авторы предлагают принципиально новый способ диагностики телэнцефального глиоза у детей с врожденными инфекциями за счет исследования определенных гистологических срезов участков мозга.

Технический результат настоящего изобретения состоит в повышении точности диагностики.

Этот результат достигается тем, что при морфологическом исследовании ткани головного мозга согласно изобретению фрагменты ткани белого вещества берут из перивентрикулярных участков мозга на уровне начальных отделов задних рогов боковых желудочков и на уровне межжелудочкового отверстия, гистологические срезы окрашивают иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител к Glial Fibrillary Acidic Protein, выявляют реактивные астроциты и по их наличию в срезе более 30% диагностируют телэнцефальный глиоз.

Аналогичных предлагаемому нами способу диагностики телэнцефального глиоза у детей с врожденными инфекциями в доступной литературе не обнаружено.

Авторы впервые показали, что наиболее информативными для диагностики являются определенные отделы перивентрикулярного белого вещества мозга, а именно начальный отдел задних рогов боковых желудочков мозга и на уровне межжелудочкового отверстия, из которых берутся фрагменты ткани мозга для исследования. При проведении исследований множества кусочков белого вещества головного мозга детей на серийных фронтальных срезах мы обнаружили наибольшую ранимость и наиболее частую повреждаемость в области начальных отделов задних рогов боковых желудочков и на уровне межжелудочкового отверстия, откуда вытекает целесообразность исследования именно указанных областей мозга для диагностики ТГ. При гистотопо-графическом исследовании мы ранее обнаружили более частое обнаружение в этих зонах и очагов ПВЛ, что указывает на патогенетическое сходство ПВЛ и ТГ. Прицельное взятие кусочков мозга из наиболее ранимых областей белого вещества мозга обеспечивает точность диагностики ТГ.

Авторы в своем способе проводили иммуногистохимическое окрашивание срезов с использованием специфической сыворотки, что позволило четко выявлять реактивные (гипертрофированные) астроциты. При окраске стандартными методами, в том числе по методу Ниссля, трудно бывает отличить астроциты от других глиальных клеток (олигодендроцитов и микроглиоцитов). При нашем способе окраски не имеет значения величина астроцитов, их ядер и цитоплазмы, нет необходимости заниматься поиском неясных по происхождению «остро поврежденных клеток глии» и редко встречающихся «амфофильных шариков», по-видимому представляющих преципитаты плазмы крови.

Данный способ осуществляется следующим способом.

Головной мозг новорожденных и детей раннего возраста извлекается из черепа и помещается в раствор 10% нейтрального формалина и фиксируется в течение 7 дней. Затем делаются плоскопараллельные срезы мозга во фронтальной плоскости. Берутся фрагменты ткани мозга из перивентрикулярных участков белого вещества мозга в 2-х местах - начальных отделах задних рогов боковых желудочков и перивентрикулярно в области наружного угла тела бокового желудочка на уровне межжелудочкового отверстия. Кусочки мозга заливаются в парафин и окрашиваются на глиофибрилярный белок астроцитов. Гистологические препараты изготавливались с использованием автоматической проводки на гистологическом процессоре замкнутого типа с вакуумом Tissue-Tek® VIP 5Junior, Sakura (Япония). Изготавливались срезы толщиной 4 мкм как наиболее оптимальные для окрашивания и дальнейшего исследования. Срезы толщиной помещались на предметные стекла с L-полизиновым покрытием. Эндогенную пероксидазу блокировали в растворе Peroxidase-Blocking Reagent, Dako, тщательно промывали в буфере с рН 7,4. Затем срезы инкубировали с первичными антителами при комнатной температуре в течение 30 минут, если не было иных указаний в прилагаемых рекомендациях от производителя. Для выявления реактивных астроцитов применяли концентрированные моноклональные мышиные антитела anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), GA-5, BioGenex, клон 6F2, в разведении 1:200. Опытным путем на серии срезов мы установили, что данное разведение является оптимальным для выявления реактивных астроцитов и не ведет к неблагоприятному фоновому окрашиванию. Концентрированные антитела разбавляли Antibody Diluent, Dako. Лиофилизированные антитела аликвотировали и хранили при температуре -20°С в низкотемпературном фармацевтическом холодильнике. При необходимости по инструкции к используемым антителам проводили демаскировку антигенов на модуле предварительной подготовки препаратов РТ Link, Dako, с использованием 3-in-1 Target Retrieval Solution, Low pH (6,0) или High pH (9,0) соответственно требованиям в инструкции к антителам. В качестве системы визуализации использовали Envision Flex, Dako, Дания с DAB+Chromogen. Затем препараты докрашивались гематоксилином, обезвоживались и заключались под покровные стекла. Параллельно ставились положительные или отрицательные контроли. Морфометрический анализ проводился на микроскопе Nicon Eclipse E200 с цифровой камерой Nicon DS-Fil, персональном компьютере с установленным програмным обеспечением NIS-Elements F 3.2. В каждом случае анализировали по 5 полей зрения при увеличении ×400. Определяли относительное число клеток с положительной экспрессией сигнала к белку GFAP, которое представляло собой отношение числа иммунопозитивных клеток к числу остальных клеток в данном поле зрения, выражаемое в процентах. Мы провели сравнительное изучение перивентрикулярного белого вещества головного мозга в двух группах детей - 1) с телэнцефальным глиозом и врожденной инфекцией (11 случаев) и 2) без патологических изменений или с отечно-геморрагическими изменениями - 12 случаев (контрольная группа). Кусочки белого вещества брали из двух мест - начальных отделов задних рогов боковых желудочков мозга и в области наружного угла средних частей боковых желудочков на уровне межжелудочкового отверстия. Проведено специальное окрашивание ткани мозга на реактивные астроциты (см. выше). Оказалось, что в отличие от контрольной группы количество астроцитов в микропрепарате при увеличении в 400 раз равнялось более 30% и иногда доходило до 80% и выше в поле зрения. В контрольной группе количество пролиферирующих астроцитов в среднем составлял 19,2±1.8%. В группе с ТГ число реактивных астроцитов в среднем составляло 57,6±3,2%. Минимальное количество реактивных (гипертрофированных) астроцитов в группе с ТГ составляло 30%. Поэтому количественным диагностическим критерием ТГ мы считаем наличие в поле зрения микропрепарата при увеличении ×400 - 30% и более реактивных (гипертрофированных) астроцитов, выявленных с помощью специфического иммуногистохимического метода.

В качестве примеров приводим несколько наблюдений.

Пример 1. Больной К., родился недоношенным при сроке беременности 36 недель, с массой 2430 г, после рождения состояние тяжелое, умер через 5 дней 16 часов. При патологоанатомическом исследовании выявлена врожденная микоплазменная инфекция. В головном мозге определяются выраженный отек, полнокровие сосудов, ишемические изменения нейронов. В белом веществе мозга определяются гипертрофированные астроциты. Взяты 2 кусочка белого вещества мозга с эпендимой желудочков на уровне начального отдела заднего отдела правого бокового желудочка и на уровне межжелудочкового отверстия в области наружного угла правого бокового желудочка мозга. Провели иммуногистохимическое исследование срезов толщиной 4 мкм на реактивные астроциты с anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (клон 6F2, фирма BioGenex). В каждом срезе определяли относительное число клеток с положительной экспрессией сигнала к белку GFAP (реактивные астроциты). Исследовали по 5 полей зрения при увеличении ×400 в каждом срезе мозга. Оказалось, что процент реактивных астроцитов в области заднего рога бокового желудочка составил 61,3±1,7, а в белом веществе мозга на уровне межжелудочкового отверстия - 53,1±2,4%. Исходя из этих данных сделано заключение о наличии у ребенка телэнцефального глиоза.

Пример 2. Ребенок С., родился при сроке 28 недель беременности с массой 1077 г, прожил 11 дней. При патологоанатомическом исследовании выявлена генерализованная энтерококковая инфекция, язвенно-некротический энцефалит, двусторонняя пневмония, внутрижелудочковое кровоизлияние 3-й степени. При микроскопическом исследовании в белом веществе мозга при окраске Г и Э обнаруживались гипертрофированные астроциты. Взяты 2 кусочка белого вещества мозга с эпендимой желудочков на уровне начального отдела заднего отдела правого бокового желудочка и на уровне межжелудочкового отверстия в области наружного угла правого бокового желудочка мозга. Провели иммуногистохимическое исследование срезов толщиной 4 мкм на реактивные астроциты с anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (клон 6F2). В каждом срезе определяли относительное число клеток с положительной экспрессией сигнала к белку GFAP (реактивные астроциты). Исследовали по 5 полей зрения при увеличении ×400 в каждом срезе мозга. Оказалось, что процент реактивных астроцитов в области заднего рога бокового желудочка составил 17,2±1,8, а на уровне межжелудочкового отверстия - 8,7±2,3%. Следовательно, процент реактивных астроцитов был менее 30, то есть менее числа, необходимого для диагностики ТГ. Выявленные другие морфологические изменения (отек, кровоизлияния, гибель олигодендроцитов) позволили обосновать наличие у ребенка ОГЛ и отвергнуть ТГ.

Следует отметить, что для нашего метода не обязательно использовать цифровую камеру и иметь соответствующее программное обеспечение компьютера, можно производить простой подсчет клеток в полях зрения и определять процент реактивных астроцитов. Не обязательно использовать специфическую сыворотку против глиофибриллярного белка (GFAP) фирмы «BioGenex» (США), можно использовать также соответствующую сыворотку фирмы «Dako» (Дания), важно, чтобы сыворотка была моноклональной, а не поликлональной.

Предлагаемый способ позволяет наиболее точно диагностировать ТГ при врожденных инфекциях у детей. Предложенный авторами способ морфологической диагностики способствует установлению раннего, точного инструментального диагноза, а следовательно, своевременному назначению соответствующей терапии.

Точная патоморфологическая диагностика нацеливает клиницистов на поиск наиболее значимых клинических симптомов ТГ, поиск нейросонографических проявлений и клинической диагностике заболевания, а также способствует разработке методов лечения и профилактики. Это ведет к решению вопросов задержки нервно-психического развития и инвализизации детей. Наш способ повышает точность диагностики ТГ, позволяет преодолевать гипердиагностику ПВЛ и проводить дифференциальную диагностику с другими поражениями белого вещества головного мозга у детей.

Формула изобретения

Способ диагностики телэнцефального глиоза у детей с врожденными инфекциями, включающий морфологическое исследование ткани головного мозга, отличающийся тем, что фрагменты ткани белого вещества берут из перивентрикулярных участков мозга на уровне начальных отделов задних рогов боковых желудочков и на уровне межжелудочкового отверстия, гистологические срезы окрашивают иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител к Glial Fibrillary Acidic Protein, выявляют реактивные астроциты и по их наличию в срезе более 30% диагностируют телэнцефальный глиоз.