Способ профилактики ранней эмбриональной смертности у крупного рогатого скота

Изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает введение в организм коровы после искусственного осеменения биологически активного вещества. В качестве биологически активного вещества вводят кондиционную эмбриональную среду, полученную в результате культивирования эмбрионов в среде CR-1. Причем в первые три дня культивирование эмбрионов осуществляют в среде CR-1 без добавления фетальной сыворотки, с 3-го по 5-й дни - в свежей среде CR-1, и с 5-го по 8-й дни - в среде CR-1 с фетальной сывороткой. Кондиционную среду вводят в точки акупунктуры тела животного на глубину 1,5-2,5 см не позднее 10-го дня (с 1-го по 10-й) после искусственного осеменения в дозе 0,2-0,4 мл. Способ обеспечивает повышение стельности после первичных осеменений на 22,1%, а рождение живых телят - на 23,3%. 1 пр.

Пренатальные потери у крупного рогатого скота, согласно данным многочисленных исследований, составляют около 30%. При этом порядка 80% эмбрионов гибнет до 17 дня, 10-15% - между 17-м и 42-м днями и 5% - после 42-го дня [Бахмут Л.Н. Диагностика и профилактика эмбриональной смертности у коров / Бахмут Л.Н., Вагенлейтнер А.В., Кононов Г.А., Римарова Л.Д., Столбов В.М., Харитошин О.Л., Шалявина Л.М. // Сельскохозяйственная биология. - М., 1994. - 4. - С.83-87].

Известен способ снижения эмбриональной смертности у коров и телок посредством препарата сурфагон, который вводят коровам и телкам однократно внутримышечно в дозе 10 мкг/гол. в различные периоды охоты [Черных В.Я. Физиологические аспекты применения сурфагона для стимуляции овуляции и повышения оплодотворяемости коров и телок / В.Я.Черных, Ю.М.Букреев, A.M.Аржаев, А.Ф.Сотникова, Н.Ф.Илюшкин // Доклады РАСХН. - 2001. - 3. - С.47-50).

Сурфагон, являясь аналогом гонадотропин-рилизинг-гормона, индуцирует высвобождение гипофизарных гонадотропинов, в частности лютеинизирующего гормона, способствующего полноценной овуляции и развитию желтого тела, необходимого для сохранения эмбриона. Данный способ позволяет повысить стельность на 9-16%.

Недостатком данного способа является то, что его эффективность зависит от дополнительных факторов, связанных с условиями кормления и содержания, физиологическим состоянием животных, гормонального статуса, упитанностью и продуктивностью, а также качеством желтого тела [Stagg, К. Follicular growth patents in long term anoestrus cyckler cows / K.Stagg, M.G.Diskin, J.M.Sreenan, J.F.Roche // Summary of papers / Irich grassland and animal production assoc., Recearch group 19th annu. meet-Dublin, 1993. - P.21-22].

Другим недостатком способа является то, что в случае снижения резервов гонадотропинов в гипофизе и ареактивности гонадотрофов к гонадотропин-рилизинг-гормону сурфагон не оказывает положительного действия [Чомаев А.М., Хмылов А.Г. Методы нормализации воспроизводительной функции у коров. - М., 2005. - 64 с. - (Пособие для ветеринарных врачей и техников по искусственному осеменению)].

Известен способ снижения эмбриональной смертности при искусственном осеменении коров и телок путем введения прогестерона в дозе 200-250 мг в виде 1-2,5%-го масляного раствора на 3-й, 4-й, 8-й, 9-10-й или 3-й, 10-й и 20-й дни после осеменения [Нетеча В.И. и др. Рекомендации по повышению эффективности воспроизводства молочного скота / Нетеча В.И., Агалакова Т.В., Перминова Л.В., Русаков Р.В. - Киров, 2001. - 80 с.].

Применение прогестерона обеспечивает гестагенную поддержку эмбриогенеза в случае снижения эндокринной активности желтого тела беременности.

Прогестерон, являясь гормоном, продуцируемым желтым телом яичника, вызывает изменения в эндометрии, подготавливая его к имплантации зародыша, снижает сократимость матки, стимулируют развитие маточных желез, продуцирующих эмбриотроф для питания зародыша.

Недостатком данного способа является необходимость многократных инъекций раствора прогестерона, что может подавлять гормональные функции желтого тела, а также является стрессовым фактором для животных, требует дополнительных затрат времени и большого количества препарата. Кроме того, введение масляного раствора прогестерона, особенно в зимний период, довольно трудоемко. Препарат противопоказан при нарушении функции печени.

Существует способ повышения оплодотворяемости и профилактики эмбриональной смертности у коров путем внутримышечного введения препаратов гонадотропина сыворотки жеребых кобыл, в частности фоллимага [Лободин К.А., Репродуктивное здоровье высокопродуктивных молочных коров красно-пестрой породы и биотехнологические методы его коррекции: автореф. дис д-pa. вет. наук: 06.02.06 / Лободин Константин Алексеевич. - М., 2010. - 32 с.].

Фоллимаг (ЗАО «Мосагроген») представляет собой гонадотропин сыворотки крови жеребых кобыл (ГСЖК) с высокой степенью очистки от иммуногенных белков, что сводит к минимуму анафилаксию у обрабатываемых животных. Препарат обладает свойствами фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов и не обладает межвидовой специфичностью. Преимуществом данного способа является то, что фоллимаг, обладая свойствами лютеинизирующего гормона, активизирует прогестеронсинтезирующую функцию желтого тела, что способствует сохранению беременности на ранних этапах развития зародыша.

Фоллимаг вводят животным внутримышечно однократно на 17-18 сутки после осеменения в дозе 2 ИЕ на 1 кг массы тела. Применение фоллимага позволило повысить долю стельных коров на 36,2%.

Недостатком способа является дозировка на основе точного определения живой массы животного, для чего необходимо дополнительное взвешивание или проведение замеров параметров тела. Передозировка препарата может привести к дисфункции яичников.

Способы с использованием гормональных препаратов имеют недостатки в экологическом аспекте, поскольку существуют ограничения по работе с ними беременных женщин и не исключена возможность попадания гормонов в продукты животноводства.

Введение экзогенных гормональных препаратов снижает выработку собственных гормонов и может привести к угнетению гуморальной регуляции организма, нарушению метаболизма, а также снижению реактивности или анафилаксии на повторное введение препарата [Филлепенко А.И. Влияние факторов внешней среды на воспроизводительную функцию и продуктивность коров / Филлипенко А.И., Голубина Л.Т. // Ветеринария, 1991. - 3. - С.67-70; Преображенский О.Н. Стресс и патология размножения с.-х. животных / О.Н. Преображенский // Ветеринария. - 1993. - 4. - С.38-41; Осетров Н.А. Эффективность восстановления и стимуляции воспроизводительной функции при алиментарном и климатическом инфантилизме телок / Н.А.Осетров // Материалы Всерос. Науч. и уч.-метод. Конф. По акушерству, гинекологии и биотехнике размножения животных. - Воронеж, 1994. - C.112-113; Farzaneh, N. Effect of GnRG agonist administrated on the time of insemenation and 11-12 days after on pregnancy rates of dairy cows / N.Farzaneh, M.A.Peyvandi, M.Bagheri, M.Mohri // 14-th International Congress on Animal Reproduction. - Stockholm, 2000. - Vol.2. - P.70; Tefera, M. Lack of effect of post-AI hCG or GnRH treatment on embrionic mortality in dairy cattle / M.Tefera, S.Chaffaux, M.Thibier, P.Humblot // Livestock Production Science. - Oct. 2001. - Vol.71. - 2-3. - P. 277-281].

Наиболее близким аналогом, взятым в качестве прототипа, является способ снижения эмбриональной смертности с помощью аналога гонадотропин-рилизинг-гормона - бусерелина [Ryan D.P., Kopel E., Boland М.Р., Godke R.A. Pregnancy rates in dairy cows following the administration of a GnRH analogue at the time of artificial insemination or at mid-cycle post insemination - Theriogenology, 1991, Sep; 36(3): 367-77]. Бусерелин вводили на 12-й день после искусственного осеменения внутримышечно однократно в дозе 10 мкг.

Стельность определяли методом ректальной пальпации между 33-м и 50-м днями после осеменения. Доля стельных животных составила 51,5% при введении гонадотропин-рилизинг-гормона, что на 11% больше, чем в группе контрольных животных.

Недостатком метода является большая вариабельность результатов в зависимости от индивидуальных гормональных резервов гипофиза, связанных с рядом факторов.

Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, заключается в создании способа снижения эмбриональной смертности у крупного рогатого скота, обеспечивающего высокий уровень рождения здорового потомства после искусственного осеменения на основе применения биоинформационного воздействия на точки акупунктуры животных биологических жидкостей, полученных в результате культивирования эмбрионов in vitro.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ профилактики ранней эмбриональной смертности у крупного рогатого скота, включающий получение кондиционных эмбриональных сред путем культивирования и экстракорпорального оплодотворения ооцитов и культивирования эмбрионов в условиях in vitro, отличающийся тем, что кондиционные эмбриональные среды вводят в биологически активные точки (точки акупунктуры) коров и телок на глубину 1,5-2,5 см в дозе 0,2-0,4 мл не позднее 10 дня (с 1-го по 10-й) после искусственного осеменения.

Технический результат изобретения выражается в увеличении процента рождения телят, стельности коров и телок после первого осеменения, сокращения сервис-периода и индекса осеменения, а также снижения экономических затрат на получение одного теленка методом искусственного осеменения.

Теоретический результат достигается за счет того, что эмбрионы продуцируют в культуру факторы, обуславливающие их выживаемость (интерфероны, ростовые факторы и др.). Воздействие малыми дозами биологических жидкостей на организм животного через биологически активные точки носит резонансный характер и обеспечивает информацией центральную нервную систему (ЦНС), благодаря наличию в зоне точки высокопроницаемых межклеточных мембран (щелевых контактов), которые являются проводниками энергии в форме электромагнитных волн. ЦНС обрабатывает эту информацию и корректирует работу органов и систем.

Теоретическим основанием для использования биологических жидкостей, продуцируемых эмбрионами, является то, что идентифицированы гуморальные факторы, продуцируемые эмбрионами и обуславливающие их выживаемость (интерфероны, ростовые факторы и др.) [Donna D. et al. Fibroblast Growth Factor-2 Is Expressed by the Bovine Uterus and Stimulates Interferon-{tau} Production in Bovine Trophectoderm. Endocrinology 2006, 147, 7: 3571-3579].

Теоретическим основанием для использования малых доз биологических жидкостей, продуцируемых эмбрионами, являются экспериментальные данные об эффектах воздействия сверхмалых доз различных препаратов и биологически активных соединений на организм животных и человека [Бурлакова Е.Б. Особенность действия сверхмалых доз биологически активных веществ и физических факторов низкой интенсивности. Российский химический журнал. 1999. Т.43. 5. С.3-11; Подколзин А.А., Гуревич К.Г. Действие биологически активных веществ в малых дозах. - КМК, 2002. - 170 с.].

Теоретическим основанием для воздействия малыми дозами биологических жидкостей на организм животного через биологически активные точки является доказательство наличия энергоинформационной системы организма [Казеев Г.В. Ветеринарная акупунктура? М., 2000, с.192, 389-390; Казеев Г.В. и др. Информационная терапия заболеваний животных по точкам акупунктуры. Материалы IX Московского Междунар. ветеринарного конгресса. М., 2001, с.251-252; Stelio P.L. Luna et al. Comparison of pharmacopuncture, aquapuncture and acepromazine for sedation of horses Evidence-based Compl. and Alt. Medicine CAM Advance Access published online on December 1, 2006]. Исследованиями доказано наличие в зоне точки высокопроницаемых межклеточных мембран (щелевых контактов), которые являются проводниками энергии в форме электромагнитных волн, динамика формирования которых зависит от функции точки. Энергетические структуры обеспечивают информацией центральную нервную систему, которая обрабатывает эту информацию, а затем корректирует работу органов и систем. Механизм действия через биологически активные точки (точки акупунктуры) представляет собой резонанс, для вызова эффекта которого и передачи импульса достаточно микродозы вещества, то есть главное не количество, а качество материала, чтобы информация была резонансной для органа [Казеев Г.В. Биоэнергетическая теория акупунктуры. - Сб. материалов науч.-практ. конф.: «Акупунктура, биоэнергетика и нетрадиционные методы лечения животных» - М., 2005. - С.7-10]. В качестве такой резонансной информационной среды можно рассматривать кондиционную эмбриональную среду.

Пример.

Была проведена оценка эффективности способа снижения эмбриональной смертности у крупного рогатого скота после искусственного осеменения при введении кондиционных эмбриональных сред в биологически активные точки.

Экстракорпоральное культивирование ооцитов коров включало транспортировку яичников от овариоэктомированных после убоя коров, извлечение ооцит-кумулюсных комплексов путем рассечения фолликулов, промывание комплексов и их культивирование в среде созревания ТС199 (Gibco), содержащей 10% фетальной сыворотки (FCS), 10 мкг/мл FSH, 0.5 мкг/мл LH, покрытой равным слоем минерального масла. Через 24 часа культивирования ооциты переносили в среду оплодотворения.

Для оплодотворения использовали замороженную сперму быка. Подготовку спермы проводили методом swim-up (Parrish et al., 1985). Сперму добавляли к ооцитам, так чтобы конечная концентрация была 1,5×106 сперматозоидов на мл. Капацитацию спермы проводили в среде Talp (модифицированный раствор Tyrode's, содержащий 6 мг/мл BSA, 10 мМ натрия лактата и 1.25 мМ натрия пирувата).

Оплодотворение проводили в модифицированной среде Tyrode's, содержащей 10 мкг/мл гепарина, 10 мкМ гипотаурина и 1 мкМ эпинефрина.

Через 18-20 часов соинкубации осторожным пипетированием ооциты отмывали от сперматозоидов и клеток кумулюса в манипуляционной среде и переносили в 500 мкл среды CR1, где предполагаемые зиготы культивировали в течение 8 дней до стадии бластоцисты. Через 3 дня культивирования в данной среде эмбрионы переносили в свежую среду, а на 5-й день к среде добавляли фетальную сыворотку.

Кондиционные среды, полученные на каждом этапе смены или по окончании культивирования, замораживали и хранили при температуре - 70°С до использования.

Кондиционированные эмбрионами среды после предварительного размораживания при комнатной температуре вводили с помощью шприца и инъекционной иглы в биологически активные точки (точки акупунктуры) коров (Топографический атлас точек акупунктуры с.-х. животных. Казеева Г.В., 2000 г.) на глубину 1,5-2,5 см в дозе 0,2-0,4 мл не позднее 10-го дня (с 1-го по 10-й день) после искусственного осеменения, то есть к моменту вылупления бластоцисты в полость матки.

Эффект данного способа достигается тем, что эмбриотропные факторы, продуцируемые эмбрионами, способны корректировать условия эмбриогенеза в материнском организме. При недостатке этих факторов и, как результат, ослаблении гестагенной активности желтого тела может наступить эмбриональная гибель. Введение эмбриотропных факторов представляет собой экзогенное усиление «эмбрионального сигнала». Наибольшая доступность и продолжительность эффекта воздействия малых и сверхмалых доз веществ обеспечивается через биологически активные точки организма.

Использование заявленного изобретения позволяет повысить долю животных, стельных от первичных осеменений (по результатам ректального исследования) до 57,1%, против 51,5% в прототипе. Повышение доли стельности, относительно контроля, при использовании заявленного изобретения составило 22,1%, против 11% в прототипе, рождение живых телят превышало контроль на 23,3%. Использование заявленного изобретения позволяет достичь 90% благополучных отелов, по сравнению с 66,7% в контроле. В прототипе данных по отелам не приводится.

Способ имеет преимущества, поскольку, во-первых, предполагает использование натуральных факторов, продуцируемых эмбрионами в сверхмалых дозах, исключающих явление анафилаксии и попадание в продукты животноводства; во-вторых, предполагает доставку эмбриотропных факторов непосредственно к органам, ответственным за воспроизводство; в-третьих, является экономически малозатратным, поскольку предполагает использование побочных продуктов технологии экстракорпорального оплодотворения.

Изобретение применимо при разведении крупного рогатого скота в хозяйствах всех категорий.

Формула изобретения

Способ профилактики ранней эмбриональной смертности у крупного рогатого скота, включающий введение в организм коровы после искусственного осеменения биологически активного вещества, отличающийся тем, что в качестве биологически активного вещества вводят кондиционную эмбриональную среду, полученную в результате культивирования эмбрионов в среде CR-1, причем в первые три дня культивирования в среде без добавления фетальной сыворотки, с 3-го по 5-й дни - в свежей среде CR-1 и с 5-го по 8-й дни - в среде CR-1 с фетальной сывороткой, при этом кондиционную среду вводят в точки акупунктуры тела животного на глубину 1,5-2,5 см не позднее 10-го дня (с 1-го по 10-й) после искусственного осеменения в дозе 0,2-0,4 мл.