Средство, обладающее москитоцидными свойствами

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в качестве средства борьбы с кровососущими комарами. Способ предусматривает выращивание штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114, депонированного в коллекции микроорганизмов Государственного Научного Центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ГНЦ ПМБ) на плотной питательной среде Чапека+ при температуре 23°С в течение 12 дней до образования сплошного воздушного мицелия со взрослыми колониями с последующим культивированием при той же температуре на среде Сабуро с добавлением дрожжевого экстракта в течение 6 дней до образования бластоспор. Полученную культуральную жидкость центрифугируют с получением фугата. Полученный фугат экстрагируют хлористым метиленом на жидкость-жидкостном экстракторе непрерывного действия в течение 30 часов. Полученный экстракт очищают растворителями различной полярности (гексаном, хлороформом, этилацетатом, метанолом) с последующим хроматографированием на флеш-хроматографии и последующем хроматографировании на жидкостном хроматографе высокого давления с получением 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона, обладающего москитоцидными свойствами. Изобретение позволяет расширить ассортимент средств для создания москитоцидных препаратов. 4 табл.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии.

Кровососущие комары являются переносчиками более 150 возбудителей болезней человека и теплокровных животных. Они являются единственными переносчиками таких болезней как малярия, желтая лихорадка, лихорадка Денге и главными переносчиками в передаче некоторых филярий и вирусных энцефалитов. Одним из путей снижения риска заболевания человека и животных трансмиссивными болезнями является контроль численности кровососущих комаров. Основным профилактическим средством борьбы с комарами является применение инсектицидных препаратов.

Известны химические средства борьбы с кровососущими комарами: карбаматы (пропоксур), фосфорорганические (малатион, темефос, фенитротион, фенатион), пиретроиды (1).

Интенсивное применение химических инсектицидов приводит к загрязнению окружающей среды и к возникновению резистентности к действующему веществу инсектицидов у большинства видов кровососущих комаров.

Известны биологические москитоцидные препараты на основе бактерий Bacillus thuringiensis israelensis и Bacillus sphaericus. Преимущество биопрепаратов перед химическими инсектицидами заключается в их селективности действия, безопасности для людей и теплокровных животных, нецелевых насекомых, гидробионтов.

Однако бактериальные москитоцидные препараты на основе Bacillus sphaericus не активны против многих видов комаров, включая переносчиков малярии. Повсеместное применение бактериальных инсектицидов привело к появлению резистентных популяций комаров (2).

Известны примеры использования грибов родов Lagenidium, Coelomomyces и Culicinomyces для борьбы с личинками кровососущих комаров (3). Грибы родов Coelomomyces и Culicinomyces имеют существенный недостаток, заключающийся в необходимости их культивирования на живых организмах. В связи с этим они не могут быть наработаны в больших количествах для широкого применения. Другим недостатком этих грибов являются заметные колебания эффективности из-за сложного цикла развития гриба в природе.

Известен москитоцидный препарат Лагинекс, выпускаемый в США с 1999 года на основе штамма гриба Lagenidium giganteum (4).

Недостатком этого препарата является то, что он неактивен против комаров рода Anopheles - переносчиков малярии. Активное начало препарата (зооспоры) токсичны для многих видов водной фауны.

Известны синтезируемые штаммом гриба Sesquicillium candelabrum метаболиты - дитерпеноидные пироны - канделалиды А-С, обладающие иммунодепрессантными свойствами /5/, а также производное изокумарина - сесканделин В, используемое для лечения заболеваний, возникающих при патологии ангиогенеза (рак, ревматический артрит, диабетическая ретинопатия) /6/.

Известно вещество 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон, продуцируемое грибом Gliocladium roseum и названное "аурантиоглиокладином" /7/. Известно, что аурантиоглиокладин применяется в качестве красителя в шампунях для окраски волос /8/. Данных об москитоцидной активности аурантиоглиокладина в литературе не найдено. Нет также данных о том, что гриб Sesquicillium candelabrum продуцирует 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон.

Задачей изобретения является получение грибного метаболита 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона, активного против различных видов кровососущих комаров.

Поставленная задача решается тем, что предлагаемый метаболит 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон продуцируется штаммом гриба Sesquicillium candelabrum F-114.

Предлагаемый метаболит активен против различных видов кровососущих комаров, в том числе против комаров рода Anopheles - переносчиков малярии.

Сущность изобретения заключается в том, что 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон выделяют из биомассы гриба Sesquicillium candelabrum F-114.

Штамм гриба Sesquicillium candelabrum выделен в 2004 году из образцов почвы Московской области и отобран для исследования его москитоцидных свойств путем скрининга 180 штаммов 48 родов микромицетов из рабочей коллекции ГНЦ ПМБ.

Штамм гриба Sesquicillium candelabrum депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного Научного Центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ГНЦ ПМБ), Оболенск, Московской области, коллекционный номер F-114.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Колонии достигают 30 мм в диаметре через 7 дней при 24°С. Оптимальная температура для роста 18-24°С, максимум 27-30°С. Обратная сторона колонии на овсяном агаре от бледно-желтоватой до бледно-оранжевой. Поверхность колонии белая, порошистая до гранулированной из-за конидиофоров и конидиальных масс, воздушный мицелий скудный или отсутствует. Конидиофоры мономорфные, кисточковидные или мутовчатые, по 3-4 в мутовке. Ножка до 100 µм высотой, до 4 µм шириной в основании, кисточки до 130 µм высотой и шириной. Первичные веточки расходящиеся, формирующие свободные боковые веточки; конечные веточки и фиалиды расходящиеся или прижатые, промежуточные фиалиды под одиночными конечными фиалидами в мутовках, иногда в мутовках вместе с конечными фиалидами, почти цилиндрические, по размеру близки к конечным фиалидам. Фиалиды бутылевидные или цилиндрические, сужающиеся в верхней части, 5-8-12 µм длиной, 3-4 µм в самой широкой части и около 1 µм шириной в верхней точке, иногда деградирующие в относительно молодых колониях. Конидии в белых колонках внахлест, гладкостенные, одноклеточные от эллипсоидных до субшаровидных, 3-5,5×1,8-3,4 µм. Штамм гриба Sesquicillium candelabrum F-114 хорошо развивается в глубинной культуре на жидкой питательной среде. Динамика накопления биомассы и изменения pH культуральной жидкости (КЖ) штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 приведена в таблице 1.

Размер гифов - толщина от 1,5 до 2,5 мкм

Биохимические признаки

Штамм гриба Sesquicillium candelabrum F-114 утилизирует глюкозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, не утилизирует арабинозу, ксилозу, лактозу, маннит, маннозу, сорбит. Не разлагает эскулин и салицин. Продуцирует фермент протеазу. Из источников азота лучше всего усваивает дрожжевой экстракт. В глубинной культуре на третьи сутки образуется пигмент желтого цвета.

Антибиотические свойства

Антибиотическую (бактерицидную) активность гриба Sesquicillium candelabrum F-114 определяли на односуточной культуре бактерии Staphylococcus aureus MRSA в чашках Петри на агаризованной среде из рыбокостной муки. Опытным путем подбирают концентрацию микроорганизмов для получения на чашках Петри сплошного газона. Стандартизацию проводят по величине оптической плотности (OD) водной суспензии тест-культуры на фотоколориметре при длине волны 590 нм. Результаты тестирования глубинной культуры штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-l14 представлены в таблице 2.

Анализ данных антибиотической активности свидетельствует о том, что к 3 суткам роста штамм гриба Sesquicillium candelabrum F-114 имеет максимальную антибиотическую активность.

Москитоцидная активность

Активность штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 и его метаболита определяли на личинках 2-го возраста комаров Aedes aegypti. Москитоцидная активность (LC50) составила: для фугата культуральной жидкости штамма гриба 5-13%; для активного метаболита гриба от 15 до 48 м.д.

Пример 1. Культивирование штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 в колбах на жидкой питательной среде

Культуру гриба выращивают на плотной питательной среде Чапека+ в чашках Петри при температуре 23°С и относительной влажности 90% в течение 12 дней до образования сплошного воздушного мицелия со зрелыми конидиями. Наработку биомассы проводят в качалочных колбах на среде Сабуро с добавлением дрожжевого экстракта. Культивирование проводят при 23°С на микробиологической качалке (260 об/мин) в течение 6 дней до выхода культуры на стационарную фазу роста и образования бластоспор. Для тестирования фугат получают центрифугированием культуральной жидкости при 4000 об/мин в течение 40 мин. Для определения LC50 используют ряд последовательных двукратных разведений фугата водой. Для определения LT50 используют смыв мицелиальной биомассы с чашек Петри. Для тестирования смывов суспензию в объеме 1 мл разбавляют водой до концентрации конидий 1×106.

Максимальный вес сухой биомассы гриба на 3-и сутки роста составляет 30,2 г/л. Морфология культуры представляет собой длинные гифы мицелия, густо переплетенные, слабоветвящиеся с жировыми включениями. Толщина гифов от 1,5 до 2,5 µм.

Москитоцидную активность штамма определяют на личинках комаров Aedes aegypti. Активность смывов определяют по смертности личинок комаров на 1, 2, 4 и 8 день с определением среднелетального времени - LT50. Активность фугата определяют по величине среднелетальной концентрации - LC50. Учет смертности личинок от фугата проводят через 24 часа. Штамм гриба Sesquicillium candelabrum F-114 характеризуется следующими значениями москитоцидной активности: LT50 смывов равна 0,5 суток; LC50 фугата культуральной жидкости равна 8,5%.

Анализ данных по динамике роста свидетельствует о том, что к 3-4 суткам штамм гриба Sesquicillium candelabrum F-114 имеет максимальную активность и отмечается выход культуры на стационарную фазу роста.

Пример 2. Выделение 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона из биомассы гриба Sesquicillium candelabrum F-114

2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон получают путем экстрагирования биомассы гриба Sesquicillium candelabrum F-114. Высушенный мицелий экстрагируют хлористым метиленом на аппарате Сокслета в течение 24 часов при 30°С. Экстракцию веществ из фугата проводят хлористым метиленом на жидкость-жидкостном экстракторе непрерывного действия в течение 30 часов. Очистку (фракционирование) сырых экстрактов проводят последовательной обработкой неполярными и полярными растворителями (гексаном, хлороформом, этилацетатом, метанолом).

Активность сырого и очищенного экстрактов из мицелия штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 характеризуется следующими показателями москитоцидной активности: сырой экстракт - 26,5 миллионных долей (м.д.); очищенный экстракт - 21,0 м.д.

Окончательную очистку производят в несколько стадий с использованием флеш-хроматографии и жидкостного хроматографа высокого давления. Для разделения фракций используют полупрепаративные колонки (250×12 мм) с носителями "Diol", "C-18" и силикагель фирмы "Phenomenex". Структуру и класс этих соединений определяют методами ИК-спектроскопии, масс-спектроскопии (с электронной ионизацией (EI), электроспрей (ESI), МАЛДИ (MALDI), а также масс-спектроскопии высокого разрешения (HRESI)) и ЯМР-спектроскопии (1 Н-ЯМР, 13С-ЯМР) на приборах с рабочими частотами для протонов 400 и 600 МГц с использованием протоколов COSY, DEPT, НМВС.

Из активного экстракта штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 получают чистый продукт и определяют его структуру. Это вещество имеет молекулярную массу 164 и брутто-формулу C 10H12O4. Его название по номенклатуре UIPAC - 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон.

Пример 3. Лабораторные испытания 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона на различных видах комаров

Москитоцидную активность 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона определяют на личинках 2-го и 4-го возраста и куколках комаров четырех видов. В емкостях по 1 мл заливают культуру штамма по 1 мл и далее разводят в 2 раза, получают ряд разведений от 100% до 12,5%. В каждую емкость помещают по 10 личинок комаров и куколок. Их содержат при 25°С в термостате. В качестве контроля берут воду. Учет результатов проводят через 24 часа. Для тестируемого метаболита определяют среднелетальную концентрацию (LC50), выраженную в миллионных долях (м.д.). Для определения среднелетального времени (LT50) учет смертности проводят каждый час. В таблицах 3-4 приведены данные о москитоцидных свойствах метаболита 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона.

Из данных таблицы 3 следует, что москитоцидная активность 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона составляет: 15-110 м.д. - для личинок комаров; 28-405 м.д. - для куколок комаров.

Представленные в таблице 4 данные указывают, что москитоцидная активность тестируемого метаболита по показателю LT50 составляет: 2-20 часов - для личинок комаров; 15-90 часов - для куколок комаров.

Данные таблиц 3-4 свидетельствуют о высокой активности метаболита 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона в отношении различных видов комаров, включая переносчиков малярии и других опасных возбудителей болезней человека и теплокровных животных.

По значениям удельной активности 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона было определено его среднее содержание в культуральной жидкости - 280 мг/л.

Таким образом, впервые установлена высокая москитоцидная активность 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона (аурантиоглиокладина). Полученные результаты позволяют рассматривать метаболит штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 (2,3 диметокси 5,6-диметил бензохинон) в качестве перспективного агента для создания москитоцидного препарата.

Источники информации

1. Малярийные комары и борьба с ними на территории Российской Федерации: Методические указания под ред. Аванесова Л.И., Максаковой Е.И. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 56 стр. 2000.

2. Кербабаев Э.Б. Кровососущие комары - паразиты животных и человека. Методы и средства борьбы с комарами. М., стр.375, 2003.

3. Scholte E-J, Knols B.G.J., Samson R.A., Takken W., Entomopathogenic fungi for mosquito control: A review, J. Insect Sci., Vol.4, pp.19-54, 2004.

4. Cuda J. P., et al. Evaluation of Lagenidium Giganteum for Biocontrol of Florida Mansonia Mosquitoes FIPR Publication 05, pp 37-113, 1995.

5. Singh S.B., Zink D.L., Dombrowski A.W., Dezeny G., Bills G.F., Felix J.P., Slaughter R.S., Goetz M.A., Candelalides A-C: novel diterpenoid pyrones from fermentations of Sesquicillium candelabrum as blockers of the voltage-gated potassium channel Kv1.3., Org Lett., Vol.25, 3(2), p.247-250. 2001.

6. Kimura, et al. Biosyntheses of Sescandelin B: New Isocoumarin Compounds Produced by the Fungus, Sesquicilium candelabrum, Biosci. Biotech. Biochem., Vol.58 (8), p.1525-1526, 1994.

7. Bentley R., Lawate W.V., Studies on coenzyme Q. The biosynthesis of aurantiogliocladin and coenzyme Q in molds, J. Biol. Cheem., vol.240, N1, P/532-540, 1965.

8. Lang G., (Saint-Gratien), Malaval A., (Aulnay-sois-Bois), Grollier J.F., (Paris), Rosenbaum G., (Asniers) Use of benzoquinines for the direct dyeing of keratin fibres, US Patent 4867751, 1989.

Формула изобретения

Средство, обладающее москитоцидными свойствами, представляющее собой 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон из штамма гриба Sesquicillium candelabrum ГНЦ ПМБ F-114.