Способ криоконсервации органов и тканей in situ

Изображения

Изобретение относится к области медицины. Способ криоконсервации органов и тканей in situ заключается в том, что биологический объект (сердце, почка и др.) охлаждают в воде до 0°С с одновременным насыщением смесью ксенона, криптона, аргона в соотношении 2,5:47,5:50 об.%, затем вытесняют воду указанной смесью газов и при давлении 1,5 атм понижают температуру до -43°С, далее снижают давление газовой среды до нормального и продолжают охлаждение до -196°С. Способ позволил добиться надежной и продолжительной криоконсервации сердца животного в составе всего организма (in situ), у пересаженного трансплантата, консервированного шесть часов от времени холодовой кардиоплегии и до момента восстановления сократительной активности, удалось добиться восстановления адекватной сердечной деятельности. 1 ил.

Изобретение относится к медицине, в частности к хирургии, и может найти применение для консервации органов и тканей.

Известен способ криоконсервации почки путем охлаждения до -70°С под защитой криопротектора - 15% диметилсульфоксид [1].

Известный способ использования в качестве холодовой защиты криопротектора ДМСО в неполной мере препятствует повреждению клеточных структур в процессе замораживания - отогрева органа из-за неравномерного распределения любых защитных веществ (глицерин, диметилсульфоксид, этиленгликоль, пропиленгликоль и др.) по объему крупного биологического объекта, появления в нем высоких температурных градиентов и ими обусловленных градиентов давления. При этом наступающая кристаллизация воды в органе распространяется от поверхности к центру неравномерно; имеет место "фронт кристаллизации", что ведет к механическому повреждению предварительно замороженных слоев и их растрескиванию.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ консервации почки путем сочетания охлаждения при температуре (+2)-(+4)°С и гипербарии аргоном при давлении (1,5-2) атм [2].

Недостатком данного способа является сравнительно невысокая надежность и продолжительность консервации, что можно объяснить недостаточно сниженным клеточным метаболизмом из-за применения температур выше 0°С.

Задача изобретения - повышение надежности и продолжительности консервации.

Поставленная задача достигается способом, заключающимся в том, что биологический объект (сердце, почка и др.) охлаждают в воде до 0°С с одновременным насыщением смесью ксенона, криптона, аргона в соотношении 2,5:47,5:50 об. %, затем вытесняют воду указанной смесью газов и при давлении 1,5 атм понижают температуру до -43°С, далее снижают давление газовой среды до нормального и продолжают охлаждение до -196°С.

Практический способ осуществляют следующим образом: в барокамере, которая опирается на стойки в горизонтальном положении и соединена с запорными вентилями, через которые прокачивается вода, нагнетается смесь инертных газов, осуществляется ее герметизация и разгерметизация, проводится ИВЛ животного.

Крыса размещается на съемном перфорированном столике из металла по центру барокамеры, вдоль ее оси.

Поступающая в барокамеру смесь ксенона, криптона, аргона в соотношении 2,5:47,5:50 об. % (смешиваются газы вне барокамеры), изготавливается из готовой стандартной смеси, содержащей 5 об. % ксенона и 95 об. % криптона, при ее разведении в соотношении 1:1 чистым аргоном.

Рабочее давление смеси инертных газов в барокамере, равное 1,5 атм, контролируется манометром и ограничивается предохранительным клапаном, соединенными с барокамерой.

Внутри барокамеры дыхание крысы поддерживается при помощи ИВЛ атмосферным воздухом, разведенным вне барокамеры в соотношении 1:1 с изготовленной смесью инертных газов и содержащим 10 об.% кислорода.

Для термометрии животного и регистрации ЭКГ барокамера снабжена герметичным электрическим вводом на крышке.

Конструкция барокамеры позволяет охлаждать находящуюся внутри крысу, сначала до 0°С непосредственно в проточной ледяной воде, затем, после выдавливания всей воды смесью инертных газов, ступенчато до -43°С и до -196°С через окружающую животное газовую среду, при погружении барокамеры, соответственно, в пары жидкого азота и в сам жидкий азот.

ИВЛ крысы, находящейся под водой в барокамере, осуществляется через интубационную трубку по изолированному от воды контуру дыхания, соединенному с двумя запорными вентилями изнутри барокамеры, с выбросом отработанных газов в атмосферу.

Под размеры барокамеры изготовлен металлический короб - криостат с теплоизолированными стенками и неизолированным дном для передачи через дно тепла в криостат.

Плотное облако паров азота вокруг барокамеры, приподнятой на стойках в криостате, образуется из тонкого слоя жидкого азота, активно кипящего на неизолированном металлическом дне криостата.

Заполнение криостата доверху жидким азотом и размещение под его дном теплоизоляционной пластины способствует погружению барокамеры с крысой в жидкий азот и продолжительному сохранению биологического объекта при температуре -196°С.

Согревание крысы, находящейся внутри барокамеры, до 0°С осуществляется через окружающую животное газовую среду при нагревании всей поверхности барокамеры теплым воздухом вне криостата.

Консервацию органов и тканей крысы в составе всего организма проводят в четыре этапа (см. чертеж).

I Этап.

Согласно чертежу, лабораторную крысу, находящуюся внутри барокамеры (1) при нормальном давлении, форсированно охлаждают до 0°С непосредственно в проточной ледяной воде. Воду прокачивают по замкнутому контуру охлаждения, через барокамеру и крошенный лед. На фоне развивающейся гипотермии крысе проводят ИВЛ смесью воздуха и инертных газов. При достижении на 28 минуте охлаждения при +7°С холодовой кардиоплегии ИВЛ смесью воздуха и инертных газов продолжают.

II Этап.

При достижении на 95 минуте охлаждения ректальной температуры 0°С ИВЛ прекращают. Перекрывают контуры водяного охлаждения и дыхания.

Смесью инертных газов в течение одной минуты выдавливают из барокамеры всю воду. Герметизируют барокамеру и резко повышают давление вокруг животного до 1,5 атм. Барокамеру (1) с крысой под в давлением 1,5 атм при ректальной температуре 0°С помещают в криостат (2) с теплоизоляцией (3) на стенках и неизолированным дном в пары жидкого азота (4) и охлаждают животное в течение 30 минут с 0°С до -43°С.

III Этап.

При достижении ректальной температуры -43°С давление в барокамере путем ее разгерметизации снижают в течение одной минуты с 1,5 атм до нормального. Под дно криостата (2) подводят теплоизоляционную пластину (5). Разгерметизированную барокамеру (1) с крысой полностью заливают жидким азотом (4) и форсированно охлаждают животное с -43°С до -196°С. Замороженный организм с биологическим объектом хранят внутри разгерметизированной барокамеры, погруженной в жидкий азот при -196°С.

IV Этап.

При необходимости проведения трансплантации барокамеру с крысой вынимают из криостата с жидким азотом. Замороженный организм с биологическим объектом постепенно, в течение 60 минут согревают от 196°С до 0°С в разгерметизированной барокамере (1), обдуваемой теплым воздухом из калорифера (6). При достижении ректальной температуры 0°С крысу вынимают из барокамеры и производят забор ее органов.

Пример. Предлагаемый способ испытывали в опытах по криоконсервации сердца крысы-донора с последующей пересадкой его крысе-реципиенту. Всего было поставлено 10 опытов. Донор - белая крыса линии "Wistar", самец, массой 300 г. Наркоз общий эфирный. Реципиент - белая крыса линии "Wistar", самец, массой 300 г. Наркоз комбинированный, гексенал - эфирный.

Крысу интубировали, фиксировали на съемном столике, устанавливали ректальный датчик температуры, электроды ЭКГ и помещали в барокамеру. Интубационную трубку соединяли с контуром дыхания. Барокамеру закрывали крышкой и приступали к охлаждению крысы в соответствии с приведенной последовательностью в три этапа. При этом экспозицию крысы при -196°С ограничивали по времени тремя часами, когда часть жидкого азота испарялась из криостата и барокамера оказывалась не полностью погруженной в хладогент. После чего животное согревали до 0°С в соответствии с четвертым этапом приведенной последовательности.

По окончании согревания у крысы-донора производили забор сердца. Выделенный трансплантат отмывали физиологическим раствором через аорту и выполняли пересадку сердца по методике "Abbott" [3] на брюшные сосуды крысы-реципиента.

Через 3,5 минуты после начала коронарной перфузии консервированное сердце полностью восстанавливало сократительную активность с пульсом 180 ударов в минуту. От начала полной остановки сердца, вызванной холодовой кардиоплегией, и до восстановления сократительной активности у пересаженного органа временной интервал был в пределах шести часов. За пересаженным сердцем наблюдали три часа, после чего крысу-реципиента выводили из эксперимента.

Возможность осуществления надежной и продолжительной криоконсервации с помощью инертных газов теоретически объясняется образованием в биологическом объекте кристаллогидратов этих газов, которые наиболее эффективны при температурах ниже 0°С.

Источники информации

1. Кирпатовский В.И., Кудрявцев Ю.В., Буров В.Н. - Проблемы криобиологии, 1992, 1, 27-32.

2. Шумаков В.И., Штенгольд Е.Ш., Онищенко Н.А. Консервация органов. - М., Медицина, 1975, 127-128.

3. Abbott С.P. A technique for heart transplantation in the rat. - Arch. Surg., 1964, 89, 4, 645-652.

Формула изобретения

Способ криоконсервации органов и тканей in situ путем сочетания охлаждения и гипербарии инертными газами, отличающийся тем, что биообъект охлаждают в воде до 0°С с одновременным насыщением смесью ксенона, криптона, аргона в соотношении 2,5:47,5:50 об.%, затем вытесняют воду указанной смесью газов и при давлении 1,5 атм понижают температуру до -43°С, далее снижают давление газовой среды до нормального и продолжают охлаждение до -196°С.

MM4A Досрочное прекращение действия патента из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 16.06.2009

Дата публикации: 10.12.2011