Способ определения нематоцидной активности авермектиновПатент на изобретение №: 2013053 Автор: Дриняев В.А., Чижов В.Н., Ковалев В.Н., Гальвидис И.Ю., Мирзаев М.Н., Мосин В.А. Патентообладатель: Дриняев Виктор Антонович, Чижов Владимир Николаевич, Ковалев Виктор Николаевич, Гальвидис Ионас Юзович, Мирзаев Микаиль Нурбагандович, Мосин Владимир Александрович Дата публикации: 30 Мая, 1994 Адрес для переписки: подача заявки11.10.1991 публикация патента30.05.1994 Использование: микробиологическая промышленность, оценка активности авермектинов. Сущность способа: готовят разведения авермектина, затем в них вносят рисовые нематоды по 10 - 20 особей, культивируют нематоды при 28 - 36 С, рН 5,5 - 8,0, в течение 1 - 3 ч, затем под микроскопом подсчитывают общее количество нематод в каждом из разведений авермектина, количество активно подвижных нематод B, количество нематод с нарушенной подвижностью C и количество неподвижных нематод D, вычисляют процент смертности нематод в каждом разведении по формуле 1 - [B + (C 0,5) + (D 0)] /A 100, находят концентрацию исследуемого образца авермектина, при которой смертность нематод составляет 50% (СК50), и определяют нематоцидную активность путем сравнения СК50 исследуемого образца авермектинов и эталонного образца известной концентрации. 2 табл. ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУИзобретение относится к микробиологической промышленности и касается производства авермектинов, продуктов жизнедеятельности Streptomyces avermitilis, обладающих акарицидным, инсектицидным и нематоцидным действиями. Известен способ определения нематоцидной активности авермектинов в системах in vivo. Авермектины скармливают мышам с кормом, которых за трое суток до этого заражают нематодами вида Nematospiroides dubuis. На 11-е, 12-е, 13-е сутки после инфицирования проверяют кал животных на наличие или отсутствие яиц нематод. На следующий день после их обнаружения животное умерщвляют и подсчитывают количество живых и мертвых нематод, а также их яиц в проксимальной части тонкой кишки. В качестве контроля используют инфицированных животных, которые не получали авермектинов. Недостатками известного способа являются его длительность и высокая трудоемкость. Продолжительность одного анализа составляет 12-15 сут. Известен способ определения нематоцидной активности в системе in vitro, а также модификация известного способа. В основу этого типа методов положено свойство авермектинов парализовывать естественное волнообразное движение нематод Вursaphelenhus lignicolus во время их культивирования в водных растворах. Недостатком этих методов является высокая трудоемкость. Продолжительность анализа в первом случае составляет 4 дня, а во втором случае - 24 ч. Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ, основанный на способности авермектинов (особенно авермектинов серии В1) парализовывать волнообразные движения свободноживущей сапробиотической нематоды Саеnorhabditis elegans в водных растворах. Техника этого метода сводится к следующим процедурам. Нематоды Саеnorhabditis elegans линии N 2 в возрасте 4-х дней в количестве 10-20 особей помещают в микроячейки, содержащие по 100 L испытуемых веществ в разных разведениях, например авермектин В1а или фильтрат культуральной жидкости Streptomyces avermitilis. Образцы культивируют в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего изучают подвижность нематод в каждом разведении в микроскопе. По соотношению между количеством неподвижных нематод и общим числом проанализированных нематод находят процент парализующего действия испытуемых веществ. Этот показатель с учетом разведения и служит величиной нематоцидной активности авермектинов. Основным недостатком известного способа является его малая точность, обусловленная рядом причин (выбором тест-объекта, критерием оценки действия авермектинов, условиями проведения культивирования и др. ). Согласно известного способа критерием оценки воздействия авермектинов на нематоды служит их парализующее действие, т. е. соотношение между числом парализованных нематод к общему числу нематод. Опыт показывает, что определение указанной величины является условием необходимым, но недостаточным, чтобы в полной мере количественно оценить воздействие авермектинов на нематоды. Было установлено (табл. 1), что после культивирования Саеnorhabditis sp. в течение 1 ч в присутствии различных концентраций ивермектина (препарат фирмы Мерк) наблюдается не два (подвижные и неподвижные нематоды), а по крайней мере три типа воздействия ивермектина на подвижность нематод. Можно наблюдать в микроскопе: активно подвижные нематоды (естественные волнообразные движения); с нарушенной подвижностью полуподвижные нематоды (характерно уменьшение числа волнообразных движений в единицу времени, нарушение в симметрии движений, наличие кругообразных движений вместо волнообразных и др. ); неподвижные нематоды. Согласно известного способа полуподвижные нематоды должны быть причислены к активно подвижным нематодам, хотя воздействие на их организм очевидно, и как показывают наблюдения, полуподвижные нематоды после отмывки от авермектинов не способны к дальнейшему развитию в системах in vitro, в то время как активно подвижные нематоды после их культивирования в растворах авермектинов и отмывания от них способны к развитию в системах in vitro. Отсюда следует, что величина парализующего действия в значительной степени определяется тем, к какому разряду нематод, подвижных или неподвижных, будут причислены полуподвижные нематоды. Следующей причиной, оказывающей существенное влияние на точность результатов, а именно на их воспроизводимость, является нестандартность условий культивирования нематод в присутствии авермектинов. Согласно известного способа культивирование нематод осуществляется при комнатной температуре без учета значений рН культуральной жидкости и значений температуры окружающей среды. Выбор нематод рода Саеnorhabditis в качестве тест-объекта для изучения влияния авермектинов также является неудачным с точки зрения воспроизводимости получаемых результатов. Известно, что жизненный цикл нематод рода Саеnorhabditis характеризуется очень высокими скоростями онтогенеза и составляет 3-6 дней. При этом в популяции можно выделить несколько возрастных групп нематод. В свежеполученной популяции Саеnorhabditis sp. , которая поддерживалась на овсяной кашице в течение 3-4 дней, помимо 20-25% погибших нематод можно выделить по меньшей мере три возрастные группы активно подвижных нематод: старые, молодые и зрелые. Они визуально отличаются друг от друга величиной тела: 1500,500 и 980 мк для старых, молодых и зрелых нематод соответственно. Хранение нематод в водном растворе в холодильнике при 7оС приводит к существенному изменению жизнеспособного возрастного состава популяции уже в первые сутки хранения по сравнению с исходным составом популяции. Иначе говоря, с возрастной точки зрения популяции нематод рода Саеnorhabditis sp. является динамической популяцией. Эта особенность физиологии нематод данного рода затрудняет получение стандартизованного тест-объекта от партии к партии, даже если предварительно будет проводиться разделение популяции по возрастным группам. Помимо этого особи, относящиеся к молодым, а также зрелым и старым возрастным группам, по разному чувствительны к авермектинам, в частности к ивермектину. По нашим данным 50% -ная гибель молодых особей наступает при концентрации вещества, равного 0,75, а у зрелых и старых особей этот эффект наступает при 1,25 мкг/мл. И, наконец, существенным недостатком, влияющим на точность получаемых результатов, является то, что в известном способе не используется опорная концентрация испытуемых веществ, т. е. концентрация, при которой наступает, например, 50% -ная гибель нематод. Применение опорной концентрации в такого типах способах позволяет провести сопоставление данных стандарта и испытуемых веществ, что в свою очередь дает возможность выражать действие веществ в весовых единицах. Цель изобретения - повышение точности способа. Цель достигается тем, что для определения нематоцидной активности авермектинов в качестве тест-объекта используют рисовую нематоду Aphelenchoides bessei. Нематоды в количестве 10-20 особей помещают в микроячейки и культивируют в 100 L 0,1 М фосфатного буфера рН 5,5-8,0 в присутствии различных концентраций авермектинов в течение 1-3 ч при 28  1оС. После культивирования определяют в микроскопе общее число нематод A, число активно подвижных нематод В, число полуподвижных нематод С, число неподвижных нематод D. Вычисляют процент смертности нематод по формуле 1 -   100% в каждом разведении. Нематоцидную активность определяют путем сравнения СК50(смертельная концентрация) испытуемого образца и стандартного образца известной концентрации. П р и м е р 1. Определение нематоцидной активности ивермектина. Готовят рабочий раствор ивермектина в 96% -ном этаноле с концентрацией 1000 мкг/мл. Из него приготавливают серию разведений вещества с концентрацией от 0,1 до 10,0 мкг/мл с помощью 0,1 М фосфатного буфера рН 6,8. Разведения вносят с микроячейки на микропланшете в количестве 100 L. В каждую микроячейку вносят по 10-20 особей нематод Aphelenchoides bessei. Микропланшетку помещают в термостат на 30оС. Через 2 ч подсчитывают в микроскопе общее количество нематод в микроячейке A, число активных подвижных нематод В, число полуподвижных нематод. Вычисляют процент смертности нематод в каждом разведении (табл. 1). Находят концентрацию вещества, при котором смертность составляет 50% . В указанных условиях она равна 1 мкг/мл. Следовательно нематоцидная активность ивермектина составляет 1 мкг/мл. П р и м е р 2. Определение нематоцидной активности ивермектина. Все процедуры проводят как в примере 1, за исключением того, что культивирование нематод Aphelenchoides bessei в присутствии ивермектина проводят в течение 1 ч. Нематоцидная активность составляет 1 мкг/мл. П р и м е р 3. Определение нематоцидной активности ивермектина. Все процедуры проводят как описано в примере 1, за исключением того, что культивирование нематод Aphelenchoides bessei в присутствии ивермектина проводят в течение 1 ч. Нематоцидная активность составляет 1 мкг/мл. Культивирование менее 1 ч влияет на точность результатов, так как смертность составляет всего 20-30% от той, которая наблюдается при культивировании не менее 1 ч. Культивирование нематод более 3 ч не приводит к значимым изменениям результатов, однако увеличивает время анализа, а следовательно, его себестоимость. П р и м е р 4. Определение нематоцидной активности ивермектина. Все процедуры проводят так как описано в примере 1, за исключением того, что рН среды культивирования составляет 5,5. Нематоцидная активность ивермектина составляет 1 мкг/мл. П р и м е р 5. Определение нематоцидной активности ивермектина. Все процедуры проводят как описано в примере 1, за исключением того, что используют среду для культивирования со значением рН на уровне 7,0. Нематоцидная активность составляет 1 мкг/мл. П р и м е р 6. Определение нематоцидной активности ивермектина. Все процедуры проводят как примере 1, за исключением того, что используют среду для культивирования со значением рН на уровне 8,0. Нематоцидная активность составляет 1 мкг/мл. Использование буферного раствора со значением рН ниже 5,5 и выше 8,0 влияет на точность получаемых результатов, так как при этом отмечается снижение подвижности нематод этого вида. П р и м е р 7. Определение нематоцидной активности авермектина В1а. Готовят рабочий раствор авермектина В1а в 96% -ном этаноле с концентрацией 1000 мкг/мл. Из него приготавливают серию разведений вещества от 5 до 15 мкг/мл. Далее условия аналогичны примеру 1. Нематоцидная активность составляет 7 мкг/мл. П р и м е р 8, Определение нематоцидной активности авермектина A1в. Готовят рабочий раствор авермектина A1в в 96% -ном этаноле с концентрацией вещества 100 мкг/мл. Из него приготавливают серию разведений вещества от 15 до 25 мкг/мл. Далее условия анализа аналогичны примеру 1. Нематоцидная активность авермектина A1в составляет 19 мкг/мл. П р и м е р 9. Определение нематоцидной активности экстрактов мицелиальной биомассы Streptomyces avermitilis BKM AC 1301. Споры штамма Streptomyces avermitilis BKM AC 1301 выращивают на агаризованной 2% -ной глюкозо-картофельной среде в течение 10 сут при 28оС. Кусочек агаризованной среды 0,5х1,0 со спорами вносят в качалочные колбы емкостью 750 мл, содержащие 50 мл посевной среды следующего состава, мас. % : глюкоза 1; кукурузный экстракт 0,3 (по техническому весу); соевая мука 1,2; аутолизат дрожжей 0,6; кальций углекислый 0,6; вида дистиллированная до 100. Глюкозу стерилизуют отдельно при 0,5 ати 30 мин и вносят в колбы в момент засева среды посевным материалом. Остальные компоненты стерилизуют при 0,8 ати 40 мин. Колбы устанавливают на качалку с числом оборотов 220 в минуту и выращивают инокулят при 28 1оС в течение 24 ч. Затем инокулят в количестве 5% передают в колбы с ферментационной средой следующего состава, мас. % : глюкоза 7; кукурузный экстракт 0,3 (по техническому весу); соевая мука 1,2; аутолизат дрожжей 0,6; вода дистиллированная до 100. Значение рН до стерилизации 6,8-7,2. Стерилизация компонентов раздельная: глюкоза стерилизуется при 0,5 ати 30 мин, а остальные компоненты при 0,8 ати 40 мин. Глюкозу вносят в колбы в момент засева среды инокулятом. Ферментацию проводят в течение 144 ч при 28 1оС. Авермектины выделяют из мицелия следующим образом. Вначале отделяют мицелий на центрифуге при 3000 оборотах в минуту в течение 20 мин. К влажному осадку мицелия, полученного из 10 мл культуральной жидкости добавляют 10 мл 96% -ного этанола и проводят экстракцию авермектинов при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 20 мин. В центрифугате после отделения мицелия при 3000 оборотах в минуту в течение 10 мин определяют нематоцидную активность. Для этого готовят серию разведений с помощью 0,1 М фосфатного буфера так, чтобы экстракты были разведены в 40, 50, 60, 70, 80 и 100 раз. В качестве стандарта используют авермектин В1а, нематоцидная активность которого составляет 7 мкг/мл. Далее условия анализа аналогичны примеру 1. Нематоцидная активность мицелиальных этанольных экстрактов Streptomyces avermitilis BKM AC 1301 составляет 350 мкг/мл. Таким образом предлагаемый способ позволяет определять нематоцидную активность как очищенных (ивермектин, авермектин В1а и авермектин A1в), так и неочищенных (мицелиальные этанольные экстракты) форм авермектинов и выражать нематоцидную активность в весовых единицах.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯСПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕМАТОЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ АВЕРМЕКТИНОВ, включающий культивирование нематод in vitro в присутствии различных концентраций исследуемого образца авермектинов с последующим подсчетом общего количества и неподвижных нематод и определение нематоцидной активности, отличающийся тем, что из нематод используют рисовую нематоду Aphelenchoides bessei, культивирование осуществляют при 28 - 36oС, pH среды 5,5 - 8,0 в течение 1 - 3 ч, дополнительно определяют количество нематод с нарушенной подвижностью, вычисляют процент смертности нематод по формуле 1 - 100% , где A - общее количество нематод; B - количество активно подвижных нематод; C - количество нематод с нарушенной подвижностью; D - количество неподвижных нематод, находят концентрацию исследуемого образца авермектина, при которой смертность нематод составляет 50% /Ск50/, а нематоцидную активность определяют путем сравнения СК50 исследуемого образца и эталонного образца известной концентрации.Популярные патенты: 2132610 Устройство обогрева сельскохозяйственных животных и птицы ... 10 и задатчики температуры цыпленка 11 и теплопродукции 12, исполнительный механизм 13 и вентиль 14; систему инфракрасного нагрева 2, включающую газовую горелку 15 с механизмами регулирования угла наклона 16 и подъема 17, электропривод 18, исполнительный механизм 19; биокалориметр 3, состоящий из трубопроводов подводного 20 и отводного 21, соединенных с корпусом 22 в верхней крышке которого установлен датчик теплового потока 23; блок управления 4, имеющий задатчики радиационных 24 и конвективных 25 потоков, датчик 26 температуры воздуха в помещении, сумматор 27 и блок сравнения 28. Блок термостатирования и моделирования температуры животного объекта 1 содержит ... 2440721 Способ определения вредоносности насекомых комплекса "гнус" для крупного рогатого скота ... является то, что применяемые до настоящего времени с этой целью средства не обеспечивают достаточно полной защитной эффективности в течение длительного времени и, в свою очередь, могут оказывать неблагоприятное воздействие на защищаемых животных, снижая их продуктивность.Имеется также более близкий к предлагаемому решению способ определения экономического ущерба, причиняемого гнусом, путем сравнения продуктивности одних и тех же животных до начала и в период массового лета и паразитирования насекомых [2]. Недостатком такого способа является то, что в период массового лета и паразитирования гнуса на пастбищах развивается хороший наиболее сочный травостой, в связи с чем ... 2048767 Способ отбора самок норок для воспроизводства ... животных, что снижает качество отбора. Известен также способ оценки резистентности организма, основанный на определении удельного показателя резистентности, характеризующего производственную функцию одной лимфоцитарной клетки в отношении выработки иммуноглобулинов класса G. Показатель резистентности определяют по формуле P G/l 100, где Р показатель резистентности, G содержание иммуноглобулинов класса, l абсолютное число лимфоцитов. При значении показателя резистентности 0,6, 0,3 и 0,3 < Р < 0,6 оценивают соответственно повышенную, пониженную и нормальную резистентность организма (а.с. СССР N 1578657,кл. G 01 N 33/53, 1990 г.). Данный способ разработан для клинического ... 2165701 Фунгицидная композиция и способ обработки культур для борьбы или профилактики грибковых заболеваний ... и относительной влажности 100% в течение 24 часов, затем были перенесены в теплицу с температурой 18oC и относительной влажностью 70%. Через 12 суток после заражения производили подсчет в процентах зараженной листовой поверхности. Путем сравнения с контрольным растением пшеницы, не обработанным активным веществом, но зараженным Puccinia recondita, был рассчитан процент разрушения фитопатогенного грибка. Полученные результаты были нанесены в виде точек, соответствующих 80% разрушения паразита на диаграмму Таммеса (Tammes), на которой по оси абсцисс отложены дозы тебуконазола в г/га, а по оси ординат - дозы бромуконазола также в г/га. Была получена диаграмма, приведенная на фиг. 1, на ... 2287923 Роторный энергосберегающий мостовой агрегат для сельскохозяйственных работ ... трактора. Другим важным фактором, влияющим на энергозатратность МТА, является сопротивление перекатыванию машины по вспаханному полю, которое в 4 раза больше, чем при движении по грунтовой дороге. Условия же работы РЭМА могут быть приравнены к движению по грунтовой дороге, так как РЭМА движется по накатанным колеям при всех видах работ. Колеи не запахиваются. Сравнительный анализ расхода топлива на пахоте, культивации и посеве на 1 га для МТА тягового класса 1,4 тонны в сумме составляет 24,8 кг/га, для РЭМА аналогичного тягового класса - 11,2 кг/га, т.е. в 2,2 раза меньше.Возможность производить перекрестный посев за один проход машины, при всех прочих равных условиях, дает прибавку ... |
Еще из этого раздела: 2399203 Способ оценки физиологического состояния организма цыплят 2270545 Посевной комбинированный агрегат 2165134 Корнеподрезающий рабочий орган машины для добычи лакричного сырья 2407280 Устройство и способ для осушения воздуха в теплице и теплица 2247490 Способ освоения закустаренных земель и устройство для его осуществления 2012206 Инсектицидная композиция для борьбы с тараканами 2124290 Препаративная форма в виде раствора для местного применения для обработки животных (варианты), способ получения и способ обработки животных (варианты) 2492640 Способ выращивания рыбы в мелководных заморных озерах с применением глубокого водоема-спутника 2105446 Плоскорежущая лапа 2241322 Навесное устройство трактора |
Изобретения в сельском хозяйстве
Обработка почвы в сельском и лесном хозяйствах
Посадка, посев, удобрение
Уборка урожая, жатва
Обработка и хранение продуктов полеводства и садоводства
Садоводство, разведение овощей, цветов, риса, фруктов, винограда, лесное хозяйство
Новые виды растений или способы их выращивания
Производство молочных продуктов
Животноводство, разведение и содержание птицы, рыбы, насекомых, рыбоводство, рыболовство
Поимка, отлов или отпугивание животных
Консервирование туш животных, или растений или их частей
Биоцидная, репеллентная, аттрактантная или регулирующая рост растений активность химических соединений или препаратов
Хлебопекарные печи, машины и прочее оборудование для хлебопечения
Машины или оборудование для приготовления или обработки теста
Обработка муки или теста для выпечки, способы выпечки, мучные изделия
|
|
||