Способ подбора особей русского осетра acipencer в аквакультуре

Международная патентная классификация:       A01K C12Q

Патент на изобретение №:      2202178

Автор:      Войнова Н.В., Корниенко И.В., Водолажский Д.И.

Патентообладатель:      Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства

Дата публикации:      20 Апреля, 2003

Начало действия патента:      3 Января, 2001

Адрес для переписки:      344007, г.Ростов-на-Дону, ул. Береговая, 21/2, АзНИИРХ, рук. гр. ПС С.М.Маронову

Изображения

Способ подбора особей русского осетра Acipencer

в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-2t.gif" > в аквакультуре относится к области рыбоводства и предназначен для заводского отбора производителей рыб. Оптимизация состоит в том, что анализируют последовательности митохондриальной ДНК русского осетра Acipencer Способ подбора особей русского осетра acipencer <img src=

в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-3t.gif" > в области D-петли методом ПЦР-амплификации с использованием прямого (ОS1) и обратного (ОS2) праймеров, а для воспроизводства подбирают особей, различных по длине ПЦР-продуктов мтДНК. Способ позволяет свести к минимуму генетическую деградацию природных популяций. 1 ил., 1 табл. , ,

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

Изобретение относится к рыбному хозяйству и предназначено для заводского отбора производителей русского осетра Acipencer Способ подбора особей русского осетра acipencer <img src=

в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-5t.gif" > В условиях интенсивного воспроизводства осетровых на рыбоводных заводах возникает проблема подбора производителей, минимизированных по показателям инбридинга (близкородственного скрещивания), особенно в условиях стремительного сокращения их численности.

Поскольку инбридинг не отвечает задаче получения потомства с максимально высоким показателем устойчивости к неблагоприятным факторам внешней среды, клонирование одних и тех же производителей с последующей интродукцией их потомства в природные водоемы наносит большой ущерб природному генофонду (в данном случае - рыб).

Известны способы отбора потенциально рыбоводнопродуктивных производителей по биометрическим (длина тела, масса тела), физиологическим (качество половых продуктов (икры и спермы), созревание производителей после инъекции и пр. ), а также биохимическим показателям (способ индивидуального отбора самок посредством прижизненного определения в крови содержания белка, липидов и холестерина) [1].

Недостатком данных способов является то, что они только выявляют подготовленность мигрантов к размножению, но не могут предотвратить снижения гетерогенности популяции осетровых.

Известен способ подбора производителей карпа из двух искусственно сформированных генетически отдаленных линий (гомозиготных по альбумино-трансферриновому комплексу плазмы крови из чешуйчатой линии (SSnn) и гетерогенному подбору по этому комплексу - разбросанной (SSnn) линии) [2].

Недостатком этого способа является то, что увеличение выживаемости молоди на 20-25%, полученной от межлинейных скрещиваний уже на уровне первого селекционного поколения, носит характер гетерозисного. Как известно, характерной чертой гетерозиса является затухание в ряду поколений [3]. Кроме того, формирование генетически отдаленных линий путем ассортативного отбора - весьма длительный и трудоемкий процесс.

Наиболее близким по технической сущности (прототип) является способ исследования изменчивости митохондриального генома у осетра Acipencer oxyrynchus desotoi [4]. С использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) показано, что 18,5% особей имеют в своих клетках несколько разных по длине вариантов митохондриальной ДНК (мтДНК), т.е. являются гетероплазмичными. Эти варианты обусловлены наличием от 1 до 4 копий последовательности длиной 81 п.н., находящихся в составе D-петли мтДНК. Параметры изменчивости мтДНК у A. oxyrynchus desotoi во многом сходны с таковыми, ранее определенными у белого осетра A. transmontanus [5] и A. Способ подбора особей русского осетра acipencer <img src=

в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-6t.gif" > Недостатком прототипа является невозможность экстраполяции на все виды осетровых ввиду уникальности раметров изменчивости мтДНК у каждого из них (применить использованные праймеры для других видов осетровых).

Цель изобретения - обеспечить решение задачи получения максимально жизнеспособного потомства от генетически удаленных друг от друга родительских линий русского осетра Acipenser Способ подбора особей русского осетра acipencer <img src=

в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-7t.gif" > и свести к минимуму генетическую деградацию природных популяций.

Эта цель достигается тем, что подбор производителей Acipenser Способ подбора особей русского осетра acipencer <img src=

в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-8t.gif" > осуществляют путем секвенс-анализа мтДНК в области D-петли методом ПЦР-амплификации с использованием прямого (OS1) и обратного (OS2) праймеров, имеющих указанную ниже структуру, а для воспроизводства подбирают особей, различных по длине ПНР-продуктов мтДНК (см. таблицу).

Сущность изобретения состоит в следующем.

Из образцов тканей выделяют ДНК, регион D-петли мтДНК исследуют методом ПЦР-амплификации с использованием прямого (OS1) и обратного (OS2) праймеров, имеющих указанную выше в таблице структуру. В качестве маркеров молекулярной массы ДНК при электрофорезе ПЦР-продуктов различных проб используют "100 Base Pair Ladder" (American Pharmacia). Методом прямого секвенс-анализа полной нуклеотидной последовательности по Сэнгеру выявляют различия в длине подуктов ПЦР-реакции (кратные 82 парам оснований). Подбор производителей русского осетра производят из разных групп, различающихся по кратности повторов 82 пар оснований в области D-петли мтДНК.

Отличительные признаки изобретения состоят в том, что впервые предложен способ подбора производителей осетровых с использованием методов молекулярной генетики, в частности тест-системы митохондриальной ДНК. В эукариотических клетках митохондриальная ДНК является полуавтономным образованием, очень удобным для молекулярно-генетической идентификации. Для этого существует, как минимум, две причины: относительно простая организация митохондриального генома и лучшая сохраняемость митохондриальной ДНК при длительном хранении образцов по сравнению с ядерной ДНК [6].

Эффективность данного способа состоит в следующем.

1. Отбор материала без травмирования производителей.

2. Скорость анализа (9 ч).

3. Возможность использования образцов из генетических коллекций.

4. Возможность консервации образцов для последующего анализа.

Пример осуществления способа.

В тест-системе представлены данные по анализу митохондриальной ДНК от 48 особей Acipenсer Способ подбора особей русского осетра acipencer <img src=

в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-9t.gif" > выловленных в Азовском море в 1997-1999 годах ихтиологами АзНИИРХ. Образцы тканей были получены из банка тканей осетровых (АзНИИРХ). ДНК выделяли по стандартной методике [7]. Регион D-петли митохондриальной ДНК был исследован методами анализа продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) для прямого (OS1) и обратного (OS2) праймеров. Структура праймеров была подобрана авторами данного изобретения для региона D-петли митохондриальной ДНК осетровых на основании данных GenBank: AJ249662, AJ249663, представленных A. Ludwig and 1. Jenneckens. Для проведения реакции ПЦР-амплификации использовали наборы реактивов: DNA Sequencing Kit, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Biosystems) и амплификатор GeneAmp PCR System 2400 (РЕ Biosystems) [8]. Предварительные тесты с тотальной ДНК человека из наборов control human DNA 1 (PE Biosystems), control human DNA 3 (PE Biosystems); control human DNA K562 (Promega), продемонстрировали высокую степень специфичности праймеров OS1 и OS2, использованных в данной работе, к митохондриальной ДНК русского осетра.

Проведен анализ продуктов ПЦР-реакции препаратов тотальной ДНК русского осетра азовской популяции с праймерами OS1 (21 пара оснований) и OS2 (23 пары оснований) методом гель-электрофореза [9] (чертеж).

Наши данные наглядно продемонстрировали случаи гетероплазмии длины митохондриальной ДНК Acipencer Способ подбора особей русского осетра acipencer <img src=

в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-10t.gif" > в пробах печени, селезенки и икры, взятых от разных особей. По длине амплифицированного участка ПЦР-продукты распределились следующим образом: 4 пробы из 28 имели длину амплифицированного участка, равную 242 парам оснований, 4 пробы из 28 имели длину амплифицированного участка, равную 324 парам оснований, и 20 проб из 28 имели длину амплифицированного участка, равную 406 парам оснований. Таким образом, анализ полной нуклеотидной последовательности методом прямого секвенс-анализа по Сэнгеру [10] позволил уточнить различия в длине продуктов ПЦР-реакции, кратные 82 парам оснований.

Различия между исследованными особями реализовывался по типу "инсерции": 4 особи из 28 исследованных не имели в своем составе ни одного повтора 82 пары нуклеотидов, 4 особи имели в своем составе 1 повтор 82 пары нуклеотидов и 20 особей из 28 исследованных имели в составе исследованного нами участка D-петли митохондриальной ДНК 2 повтора по 82 пары нуклеотидов.

Наглядно продемонстрирована гетерогенность популяции русского осетра Acipencer Способ подбора особей русского осетра acipencer <img src=

в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-11t.gif" > Азовского моря, в пределах доступной нам выборки (48 особей), реализованная через существование, как минимум, четырех групп, различающихся по кратности повторов 82 пар оснований, в области D-петли митохондриальной ДНК [5]: 1. Первая группа - 0 повторов - 242 пар оснований.

2. Вторая группа - 1 повтор - 324 пары оснований.

3. Третья группа - 2 повтора - 406 пар оснований.

4. Четвертая группа - 3 повтора - 488 пар оснований.

Подбор производителей должен осуществляться из разных групп, например 1 гр.+2 гр., 1+3, 1+4, 2+3, 2+4, 3+4.

Полученные данные демонстрируют высокопроизводительный и специфичный экспериментальный подход для анализа структуры популяций осетровых как в природных условиях, так и в условиях рыбоводных хозяйств.

Практическое значение изобретения состоит в понижении инбридинга и получении жизнеспособного потомства осетра Acipencer Способ подбора особей русского осетра acipencer <img src=

в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-12t.gif" > при искусственном воспроизводстве.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ 1. Сборник инструкций и нормативно-методических указаний по промышленному разведению осетровых рыб в Каспийском и Азовском бассейнах. - М.: Всесоюзный научно-исследовательский институт морского рыбного хозяйства и океанографии, 1986, с.36-47.

2. Биологические основы формирования маточных стад карпа в тепловодном рыбоводстве: Автореф. дис. канд. биол. наук / Законнова Л.И. - Тюмень: Тюмен. гос. ун-т, 1999. - 19 с.: ил. -Рус.

3. Инге-Вечтомов С. Г. Генетика с основами селекции. М.: Высшая школа, 1989, с.557-560.

4. Tandem repeat sequence variation and length heteroplasmy in the mitochondrial DNA D-loop of the threatened Gulf of Mexico sturgeon, Acipenser oxyrhynchus desotoi / Miracle A.L., Campton D.E. // J. Hered. - 1995. - 86, N1. - 22-27.

5. Buroker N.E., Brown J.R., Gilbert T.A., O"Hara P.J. end all. Length Heteroplasmy of sturgeon Mitochondrial DNA: An Illegitimate Elongation Model. Genetics 124:157-163 (January, 1990).

6. Holland M.M., Fisher D.L., Roby R.K., Ruderman J., Bryson C., and Weedn W. (1995). Mitochondrial DNA sequence analysis of human remains. Crime Lab. Dig. 22, 109-115.

7. Schneider P.M. Recovery of High-Molecular-Weight DNA from Blood and Forensic Specimens. From: Methods in Molecular Biology, Vol. 98: Forensic DNA Profiling Protocols Edited by: P.J. Lincoln and J. Thomson Способ подбора особей русского осетра acipencer <img src=

в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/169.gif" ALIGN="BASELINE">Humana Press Inc., Totowa, NJ, P.P.1-7.

8. Чемерис А.В., Ахунов Э.Д., Вахитов В.А. Секвенирование ДНК. Москва, "Наука", 1999, с.169-175.

9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Москва, "Мир", 1984.

10. Sanger F., Nicklen S. and Coulson A.R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci: USA, 74: 5463-5467.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ подбора особей русского осетра Acipencer

в аквакультуре, патент № 2202178" SRC="/images/patents/268/2202178/2202178-13t.gif" > в аквакультуре, включающий секвенс-анализ митохондриальной ДНК в области D-петли методом ПЦР-амплификации, отличающийся тем, что в процессе анализа используются прямой (ОS1) и обратный (ОS2) праймеры, имеющие указанную ниже в таблице структуру, а для воспроизводства подбирают особей, различных по длине ПЦР-продуктов мтДНК (см. графическую часть).

Популярные патенты:

2423036 Биоконтейнер для посадки растений

... биоконтейнера сохранять свою целостность при хранении и транспортировке (длительная прочность) обеспечивается за счет подбора усилия прессования для каждого набора биологически усваиваемых веществ. При дражировании, напротив, обязательно использование клеящих или цементирующих веществ. Без них длительная прочность оболочки не достигается. В качестве связующих веществ, как правило, используются вещества, не являющиеся биологически усваиваемыми, т.е. они являются балластными веществами, лишь затрудняющими разрушение оболочки биоконтейнера и замедляющими развитие посаженного растения.В биоконтейнерах выполняется полость для размещения в ней посадочного материала в форме семени, ...

2057432 Биологический состав кузнецова для подсочки деревьев, в том числе каучуконосов (варианты), и способ его приготовления

... белка и водорастворимых витаминов группы B, он содержит сухой хлебный квас совместно с отходами хлебных продуктов, или солод, или меласскую барду, или проросшее зерно. 4. Состав по п.1, отличающийся тем, что в качестве ферментного препарата бактериального происхождения, содержащего щелочную протеазу, он содержит протосубтилин 10x бактериального происхождения в количестве 0,015 0,025 мас. или протосубтилин 20x в количестве 0,0075 0,012 мас. или протосубтилин ГЗx в количестве 0,5 1,0 мас. или другие ферментные препараты бактериального происхождения, содержащие щелочную протеазу с рН среды 7,5 10,5. 5. Состав по п.1, отличающийся тем, что в качестве компонента, содержащего ...

2395497 Способ стимулирования роста подсолнечника регулятором роста

... для активации прорастания семян. Однако гиббереллин - дорогостоящий продукт микробиологического синтеза и малодоступен. Его применение вызывает нерациональную трату пластических масс [2. Г.С.Муромцев и др. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений. - М.: Агропромиздат, 1987. - С.33-80].Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала биологически активных веществ, полученных синтетическим путем, для применения их в сельском хозяйстве в качестве регуляторов роста растений.Это достигается применением О-(замещенный фенил)карбонил-4,6-диметил-2-хлорпиридил-3-амидоксимов 1-2 путем предпосевной обработки семян подсолнечника. При этом O-(замещенный ...

2182420 Устройство для перерезания стволов деревьев

... является устройство для перерезания стволов деревьев, содержащее стойку, закрепленную на лесозаготовительной машине, на которой смонтированы с возможностью поворота от силовых цилиндров верхний и нижний рычаги для захвата перерезаемого ствола дерева, и срезающий механизм, имеющий режущий орган, перемещаемый приводом (см., например, книгу Горбачева Н. Н. и др. Машины для лесосечных работ. - М.: Лесная промышленность, 1988, с. 79-84). Недостатком известного устройства является его невысокая надежность, связанная с эксплуатацией цепной пилы, являющейся его режущим органом, поскольку высокая скорость движения шарнирно соединенных резцов пильной цепи по полотну, необходимая для ...

2472951 Машина (варианты)

... вариатор сотовой передачи. Прокат таких деталей содержит замочное звено в виде шара /узла/ для отбора силы привода колес, осей, прицепов. Гибкость передачи допускает поворот колес. Спицы /лопатки/ делают колесо винтом - водоходным движителем.Сотовый вариатор и нить с резиновой оболочкой составляют привод потребителей в режим качения, шагания их сочетания и повторения работ. Сигнал о нагрузке в виде натяжения нити пружиной регулируемой упругости /нагрузки/ применим для саморегуляции скорости без усилителя. Формула изобретения 1. Машина, содержащая поршни на штоках в цилиндрах двигателя, силовую передачу энергии к потребителям (колесам и рабочим органам) и механизм ...

Еще из этого раздела:

2281645 Устройство для размещения цветов и растений с подсветкой (варианты)

2012206 Инсектицидная композиция для борьбы с тараканами

2201663 Устройство для ориентированной посадки лука

2250583 Агрегат дернинный комбинированный

2233582 Устройство для охлаждения молока

2051553 Устройство для обезвоживания навоза

2007081 Способ биологической борьбы с вредителями капусты

2264065 Способ возделывания сельскохозяйственных культур на корм

2051575 Способ отделения дождевых червей от среды обитания и устройство для его осуществления

2459398 Способ рекультивации почв, загрязненных минерализованными водами

Изобретения в сфере сельского хозяйства, животноводства, рыболовства

Способ подбора особей русского осетра acipencer в аквакультуре

Изображения

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ