Способ получения трансформированных растений кукурузы in vitroПатент на изобретение №: 2196421 Автор: Данилова С.А., Долгих Ю.И. Патентообладатель: Институт физиологии растений РАН Дата публикации: 20 Января, 2003 Начало действия патента: 28 Июня, 2001 Адрес для переписки: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35, Институт физиологии растений РАН, патентная служба Изображения  Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам генетической инженерии, и может быть использовано как в сельском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области физиологии растений. Трансформированную кукурузу in vitro получают кокультивированием эксплантов растений кукурузы на питательной среде с агробактериями, предварительно активизированными экссудатом табака, с последующим добавлением антибиотиков. Кокультивирование эксплантов кукурузы проводят на газоне агробактерий в течение одного пассажа культивирования, в качестве эксплантов используют как незрелые зародыши, так и эмбриогенный каллус. Добавляют антибиотики поэтапно, сначала цефотаксим в течение шести пассажей в концентрации 100-300 мг/л, а затем канамицин для отбора канамициноустойчивых растений. Способ обеспечивает увеличение выхода канамициноустойчивых растений от 8,1 до 21,6 для незрелых зародышей и от 14,5 до 40,1 для эмбриогенного каллуса при стабильной воспроизводимости результатов, а также улучшение его технологичности по сравнению с баллистическим методом за счет неприменения энергоемкого специального оборудования и эффективного использования растительного материала. 1 табл. , ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУИзобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам генетической инженерии, и может быть использовано как в сельском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области физиологии растений. В настоящее время при получении трансгенных растений метод агробактериальной трансформации кукурузы не нашел широкого применения из-за низкого выхода регенерантов, а при получении коммерческих сортов кукурузы используют метод баллистической трансформации, основанный на переносе различных генов с использованием специальной установки, основанной на неестественном (на химически инертные металлы наносятся вводимые гены, которые внедряются в клеточные структуры под давлением). При использовании этого метода частота появления трансформированных растений достигает только 3% (Brettschneider R., Becker D. , Lorz H. Efficient transformation of scutellar tissue of maize embryos. // Theor. Appl. Genet. - 1997 - v.94 - p.737-748). Известен способ получения трансформированных растений (Драйпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р. (Ред.) Генная инженерия растений. - М.: Мир. - 1991. - 408 с.). Этот способ заключается в кокультивировании эксплантов растений с агробактериями в жидкой питательной среде, с последующим культивированием на твердой питательной среде, содержащей антибиотики, один - элеминирующий рост агробактерий и другой - селективный агент, в частности антибиотик канамицин. Недостаток этого способа заключается в том, что при применении его к культуре тканей кукурузы происходят ингибирование морфогенеза и подавление регенерации. Известен способ получения трансформированных растений кукурузы in vitro, заключающийся в кокультивировании незрелых зародышей кукурузы с агробактериями, предварительно обработанными эссудатом табака, последующем встряхивании на приборе "vortox" и культивированием на твердой питательной среде, содержащей антибиотики (Ishida Y., Saito H., Ohta S., Hiei Y., Komari Т., Kumashiro T. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. // Nat. Biotechnology - 1996 - v.14 - p.745-750). Недостатком этого способа является малый выход трансформированной кукурузы, нестабильность воспроизводимости результатов, использование в качестве эксплантов только незрелых зародышей и нетехнологичность процесса, а именно его трудоемкость. Задачей настоящего изобретения является создание такого способа получения трансформированных растений кукурузы, который бы обеспечивал увеличение выхода канамициноустойчивых растений, стабильность воспроизводимости результатов, использование в качестве эксплантов как незрелых зародышей, так и эмбриогенного каллуса и улучшение его технологичности. Эта задача решается новым способом получения трансформированной кукурузы in vitro, заключающийся в кокультивировании эксплантов растений кукурузы на питательной среде с агробактериями, преварительно активизированными экссудатом табака, с последующим добавлением антибиотиков, причем кокультивирование эксплантов кукурузы проводят на газоне агробактерий в течение одного пассажа культивирования, в качестве эксплантов используют как незрелые зародыши, так и эмбриогенный каллус, а добавление антибиотиков проводят поэтапно: сначала цефотаксим в течение шести пассажей в концентрации 100-300 мг/л, а затем канамицин для отбора канамициноустойчивых растений. Заявляемые пределы концентрации цефотаксима определяются следующим образом: использование концентрации ниже 100 мг/л не элиминируют агробактерии, а при использовании концентрации выше 300 мг/л подавляется регенерационная способность эмбриогенного каллуса. Сущность изобретения, по мнению авторов, заключается в том, что в предлагаемом способе кокультивирования эксплантов осуществляют на газоне агробактерий, который выращивают на твердой питательной среде для роста кукурузы, что не ингибирует активность морфогенеза и регенерацию растений, а поэтапное добавление пониженных доз цефатоксима вызывает не только элиминацию агробактерий, но и стимуляцию регенерации. При поэтапном добавлении антибиотиков происходит разделение процесса элиминации с одновременной стимуляцией регенерации и последующей селекцией уже полученных регенерантов. Изобретение иллюстрируется следующими примерами, причем результаты, представленные в примерах 1-6, являются воспроизводимыми и математически усредненными, они приведены в таблице. Пример 1. Незрелые зародыши кукурузы линии 91 (Долгих Ю.И., Ларина С.Н., Шамина З.Б., Жданова Н.Е., Пустовойтова Т.Н. Засухоустойчивость растений кукурузы, полученных из устойчивых к осмотическому действию полиэтиленгликоля клеточных линий. //Физиология растений - 1994 - т.41 - 6 - с.853-858), линия А 188 (Green C.E. Somatic embryogenesis and plant regeneration from friable callus of Zea mais. // In plant tissue culture, maruzen со., Tokyo, Japan - 1982 - Ed. Fujiwara A. - p. 107-108) и гибрид между этими линиями А188х91 кокультивируют на твердой питательной среде с агробактериями (газон), предварительно активизированными экссудатом табака, в течение 20 дней (один пассаж). Затем переносят на среду, содержащую антибиотик цефотаксим (Сх) в концентрации 100 мг/л для элиминации агробактерий и стимуляции регенерантов. Полученные регенеранты высаживают на среду с антибиотиком канамицин (Км) в концентрации 25 мг/л. Трансфекция генов подтверждена молекулярными анализами, такими как ПЦР и гибридизация по Саузерну. Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют Сх - 200 мг/л. Пример 3. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют Сх - 300 мг/л. Пример 4. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что в качестве эксплантов используют эмбриогенный каллус трех линий 91, А 188 и гибрид между ними (А188х91), а концентрация Сх - 100 мг/л. Пример 5. Проводят аналогично примеру 4, с той лишь разницей, что концентрация Сх - 200 мг/л Пример 6. Проводят аналогично примеру 4, с той лишь разницей, что используют Сх - 300 мг/л. В результате настоящего способа обеспечено увеличение выхода канамициноустойчивых растений от 8,1 до 21,6 для незрелых зародышей и от 14,5 до 40,1 для эмбриогенного каллуса при стабильной воспроизводимости результатов, а также улучшение его технологичности по сравнению с баллистическим методом за счет неприменения энергоемкого специального оборудования и эффективного использования растительного материала.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯСпособ получения трансформированной кукурузы in vitro, заключающийся в кокультивировании эксплантов растений кукурузы на питательной среде с агробактериями, предварительно активизированными экссудатом табака, с последующим добавлением антибиотиков, отличающийся тем, что кокультивирование эксплантов кукурузы проводят на газоне агробактерий в течение одного пассажа культивирования, в качестве эксплантов используют как незрелые зародыши, так и эмбриогенный каллус, а добавление антибиотиков проводят поэтапно, сначала цефотаксим в течение шести пассажей в концентрации 100-300 мг/л, а затем канамицин для отбора канамициноустойчивых растений.Популярные патенты: 2053664 Медогонка ... медогонка конструктивно проста, технологична в изготовлении, не имеет аналога в выпускаемом оборудовании аналогичного назначения и может использоваться во всех хозяйствах страны и, таким образом отвечает требованию "промышленное применение изобретения". На фиг. 1 изображена медогонка, общий вид, вид сбоку; на фиг. 2 общий вид медогонки (вид сверху); на фиг. 3 общий вид ротора с держателями рамок; на фиг. 4 узел установки ротора; на фиг. 5 узел крепления рамки. Медогонка включает бак 1 с крышкой 2 и съемными опорами 3, ротор расположенный в нем с вертикальной осью вращения и приводное устройство. Ротор содержит вал 4, установленный посредством шарика 5 в подпятнике 6, ... 2440708 Комбинированное устройство для ротационного внутрипочвенного рыхления ... кинематических элементов привода и долговечности комбинированного устройства для ротационного внутрипочвенного рыхления.Техническим результатом, получаемым при практическом использовании изобретения, является создание возможности производить при движении устройства в почве поделку щелей для поглощения воды и выполнять фрезерование внутренних слоев почвы с высоким качеством, надежностью, меньшими затратами энергии и высокой долговечностью устройства. Для решения поставленной технической задачи предлагаемое комбинированное устройство для ротационного внутрипочвенного рыхления, содержащее два ротационных щелереза, расположенных вертикально симметрично вдоль хода движения устройства, ... 2127256 Замещенные простые оксимовые эфиры и фунгицидное, инсектицидное, арахноицидное средство ... опытов приведены в табл. 15. Вторая и третья колонки табл.15 относятся к порогу действия, а именно к минимальной концентрации, при которой достигается по меньшей мере 60%-ное повреждение соответствующего вредителя, по отношению к которому применяется испытываемое соединение. 25A - Tetranychus urticae, бобовый паутинный клещ Вид опытов - контактное действие, опрыскивание Проведение опытов Выращенные в горшке кустовые бобы с полностью развитой парой листьев опрыскивались в кабине водным раствором активного вещества до образования капель. Затем растения с помощью направляющей шины перемещались на вращающийся поддон кабины и опрыскивались со всех сторон с помощью трех различно ... 2302109 Способ снижения уровня никеля и свинца в крови и молоке коров техногенной провинции ... способ введения в рацион тиосульфата натрия в дозе 25,0 г на голову в сутки в течение 10 дней. Прозрачные кристаллы препарата легко растворимы в воде и распадаются в кислой среде на серу и сернистый ангидрид. Сера в момент своего выделения действует восстанавливающе на белки, препятствуют их переходу в более плотные соединения. Кроме того, тиосульфат натрия действует стимулирующе на организм животного, благоприятно влияет на окислительно-восстановительные процессы, уменьшает ацидоз, повышает диурез и тем самым способствует выделению ядовитых продуктов из организма.При отравлении тяжелыми металлами тиосульфат натрия действует как противоядие, переводя их в менее ядовитые ... 2091380 Производные пиколиновой кислоты или их кислотно-аддитивные соли, способ их получения, нербицидная композиция и способ борьбы с сорняками ... 10 ар. Растения затем содержались в теплице, а оценка эффективности гербицидного действия проводилась на 21-й день после обработки в соответствии с оценками, представленными в табл. 3. Результаты показаны в табл. 4. Пример испытания 2 Испытание гербицидного эффекта на возвышенном поле, обработка почвы. Пластиковый лоток (площадь поверхности 100 см2) наполнялся почвой рисового поля, в него высевали куриное просо (Ec), горец перечный (Po), щирицу (Am), марь белую (Ch) и сыпь вееровидную (Ci) и закрывали почвой. Смачиваемый порошок, приготовленный в соответствии с примером препаративной формы 2, разбавлялся водой и с помощью распылителя небольшого размера равномерно наносился на ... |
Еще из этого раздела: 2208312 Способ измерения количества молока в потоке и устройство для его осуществления 2423036 Биоконтейнер для посадки растений 2025945 Способ выращивания насаждений сосны 2442301 Устройство почвообрабатывающего орудия 2260930 Способ внесения органических удобрений 2450501 Способ повышения плодородия почвы на склонах 2196403 Почвообрабатывающий модуль 2161402 Способ акселерационного содержания и разведения кроликов 2021671 Машина для уборки льна-долгунца 2271092 Сортировка барабанного типа |
Изобретения в сельском хозяйстве
Обработка почвы в сельском и лесном хозяйствах
Посадка, посев, удобрение
Уборка урожая, жатва
Обработка и хранение продуктов полеводства и садоводства
Садоводство, разведение овощей, цветов, риса, фруктов, винограда, лесное хозяйство
Новые виды растений или способы их выращивания
Производство молочных продуктов
Животноводство, разведение и содержание птицы, рыбы, насекомых, рыбоводство, рыболовство
Поимка, отлов или отпугивание животных
Консервирование туш животных, или растений или их частей
Биоцидная, репеллентная, аттрактантная или регулирующая рост растений активность химических соединений или препаратов
Хлебопекарные печи, машины и прочее оборудование для хлебопечения
Машины или оборудование для приготовления или обработки теста
Обработка муки или теста для выпечки, способы выпечки, мучные изделия
|
|
||