Гранулированный состав, содержащий микроорганизмы, способ его приготовления и его применениеПатент на изобретение №: 2160990 Автор: Маргарет Энзманн (DE), Вильям Бэттиг (CH) Патентообладатель: Новартис А.Г. (CH) Дата публикации: 27 Декабря, 2000 Начало действия патента: 3 Июля, 1995 Адрес для переписки: 101000, Москва, Малый Златоустинский пер. д.10, кв.15, "ЕВРОМАРКПАТ", Веселицкой И.А. Изображения    Изобретение относится к микробиологии и касается гранулированного состава, содержащего микроорганизмы, и способа его получения. Получен гранулированный состав, включающий тонкодисперсный субстрат, полимерный слой, содержащий микроорганизмы и воду. Полимер представляет собой пленкообразующий, водорастворимый и практически несшитый полимер или пленкообразующий структурно-сшитый полисахарид, содержащий карбоксильные группы и набухающий в воде в присутствии ионов калия. В качестве субстрата состав содержит измельченные отруби, солому, древесную пыль, целлюлозу, глину, атрапульгит, кизельгур, вермикулит и другие вещества. В качестве пленкообразующего водорастворимого полимера он содержит гомополимер или сополимер поливинилового спирта, полиэтиленгликоля или поливинилпирролидон, полиакриламиды, крахмал, каррагенан, альгинат, ксантан, смолу рожкового дерева, метилцеллюлозу. Из микроорганизмов - Pseudomonas, Penicillium и др. Способ получения состава предусматривает суспендирование полимера или полисахарида и микроорганизма и набрызгивание полученной суспензии на тонкодисперсный субстрат и удаление воды до содержания ее в составе 0,5 - 40%. Полученный гранулированный состав, содержащий микроорганизмы, стабилен в процессе хранения при комнатной температуре. 2 с. и 41 з.п. ф-лы, 6 табл. Изобретение относится к гранулированному составу, содержащему (1) твердый водонерастворимый и тонкоизмельченный субстрат, (2) водорастворимый или набухающий в воде пленкообразующий полимер, который не является ковалентно сшитым или который сшит поливалентными катионами, (3) микроорганизмы и (4) воду. Изобретение далее относится к способу приготовления указанного гранулированного состава и к его применению для защиты растений от болезней и насекомых. Защита растений с использованием спорообразующих или растительных клеток (микроорганизмов) в последнее время приобрела большое значение. Предпосылкой для использования таких агентов для биологической борьбы является способность к получению из них полезных препаративных форм, таких, как суспензионные концентраты, диспергируемые порошки, гранулы или в частности разбрасываемые гранулы. Приготовление препаративных форм, однако, связано с большими трудностями. Например, для приготовления препаративных форм на основе большинства растительных клеток, а также некоторых спор нельзя использовать способ, осуществляемый при температурах выше 40oC, так как микроорганизмы при этом повреждаются и наблюдается значительная потеря их жизнеспособности. Хранение также связано с определенными проблемами, так как невозможно избежать потерь жизнеспособности в условиях окружающей среды, что приводит к гибели клеток, или обусловлено необходимостью хранения составов при низкой температуре, чтобы избежать потери жизнеспособности. Большинство известных составов на основе микроорганизмов представляют собой полимерные гели, сшитые поливалентными катионами и содержащие эти микроорганизмы. Такой состав описан среди прочего у D.R.Fravel et al. в Phytopathology, т. 75, N 7, 774-777, 1985, в котором в качестве полимера используется альгинат. В этом же источнике описано использование субстратов как необходимой составной части такого состава. Приготовление этих составов обычно осуществляют путем смешения растворов природных или синтетических гелеобразующих полимеров, например, альгинатов, и водных растворов ионов поливалентных металлов с получением отдельных капель, причем микроорганизмы могут быть суспендированы в одном или в обоих реакционных растворах. Образование геля начинается, когда суспензию микроорганизма добавляют по каплям к раствору желирующего агента. Эти частицы геля могут быть затем высушены. Этот способ называется ионотропным гелеобразованием. В зависимости от степени сушки этот способ позволяет получать компактные и твердые гранулы полимеров, которые сшиты поливалентными катионами и которые содержат микроорганизмы и субстрат, которые распределены практически равномерно. Размер частиц может составлять до 5 мм. В ЕР-А1-0097571 описаны составы на основе частично сшитых полисахаридов, которые помимо микроорганизма могут содержать тонкодисперсную кремниевую кислоту в качестве субстрата, а сшивку можно осуществлять ионами Ca++. Водная активность составов может быть не более 0,3. В обзорной статье у W.J.Connick et al., посвященной различным составам, в New Directions in Biological Control: Alternatives for Supressing Agricultural Pests and Diseases, стр. 345-372, Alan R. Liss, Inc. (1990), описаны гранулированные составы с вермикулитом в качестве субстрата и компактные альгинатные гранулы, полученные путем ионотропного гелеобразования. Такие составы описаны также у D.R.Fravel в Pesticide Formulations and Application Systems: 11th Volume, ASTM STP 1112 American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 1992, стр. 173-179. Недостаток этих составов на основе сшитых гелей заключается в медленном выделении агента биологической борьбы, т.к. гели не растворяются в воде и обычно образуются большие частицы с диаметром, превышающим несколько мм. Если необходимо более быстрое выделение, составы должны быть предварительно обработаны, обычно буферными растворами. Это затруднительно для потребителя и снижает безопасность при работе с ними. При более высоких плотностях популяции (> 109 КОЕ/г, т.е. колониеобразующих единиц на г), которые необходимы для снижения нормы расхода, системы обычно не обладают достаточной стабильностью, а с целью избежать значительных потерь необходимо хранение при пониженных температурах. Для приготовления составов гелеобразующие полимеры необходимо растворять в воде, что в некоторых случаях является затруднительным и возможно только при повышенных температурах. Образование капель геля является необходимой стадией процесса для получения соответствующих гранулированных составов. Наличие устройства для осуществления такого процесса в промышленном масштабе следует считать затруднительным и дорогостоящим. Полученные таким образом частицы все еще имеют высокое содержание воды, которое должно быть уменьшено путем сушки для обеспечения приемлемой стабильности при хранении. Эта стадия сушки приводит к еще большему удорожанию процесса, микроорганизмы могут подвергаться еще большему риску разрушения, а их жизнестойкость уменьшается в еще большей степени. До настоящего времени не были известны стабильные при хранении гранулированные составы на основе растворимых или набухающих в воде полимеров, приготавливаемые без ионотропного гелеобразования. Неожиданно было установлено, что существует возможность (а) приготовить гранулированные составы микроорганизмов в полимерном слое без ионотропного гелеобразования и частично без полного растворения полимера, (б) значительно уменьшить потери, вызванные гибелью живых клеток при сушке, (в) достигнуть высокой стабильности при хранении, в частности в условиях окружающей среды, (г) достичь очень высоких плотностей популяции микроорганизмов при обеспечении превосходной стабильности при хранении, (д) достичь быстрого выделения агента биологической борьбы и (е) осуществить превосходную стабилизацию клеток бактерий растительного происхождения за счет нанесения микроорганизмов в растворимом или набухающем в воде пленкообразующем полимере, который не является ковалентно сшитым или который сшит поливалентными катионами, на субстрат или вместе с субстратом, при этом состав содержит не менее 0,5 вес. % воды в пересчете на весь состав. Одним из объектов изобретения является гранулированный состав, представляющий собой тонкодисперсный субстрат и полимерный слой, содержащий микроорганизмы, причем этот полимер представляет собой (а) пленкообразующий, водорастворимый и практически несшитый полимер, при этом гранулированный состав содержит не менее 0,5 вес.% воды в пересчете на состав, или (б) пленкооборазующий структурно-сшитый полисахарид, который содержит карбоксильные или сульфатные группы и набухает в воде в присутствии ионов калия, при этом гранулированный состав содержит не менее 0,5 вес.% воды в пересчете на состав. В контексте настоящего описания понятие "практически несшитый" означает, что не добавляют мономерные сшивающие агенты, которые приводят к образованию ковалентных связей, или поливалентные катионы, которые приводят к ионотропному гелеобразованию. "Структурно-сшитый" в контексте настоящего описания означает образование пространственной сетки одного полимера или смеси двух полимеров с водородными связями или за счет электростатического взаимодействия ионов калия. При этом образуется термообратимая пространственная структура (гель), которая при нагревании снова растворяется. Типичными примерами являются выраженная в виде двойной спирали структура каррагенана в присутствии ионов калия или структурное образование смеси каррагенана и смолы рожкового дерева. Термически необратимое структурное образование при помощи поливалентных ионов не подпадает под вышеуказанное определение. На повторяющееся звено полисахарида может приходиться одна или несколько карбоксильных или сульфатных групп. "Водорастворимый" в контексте настоящего описания означает, что можно получить по меньшей мере 0,5%-ный по весу водный раствор полимера при температуре от 5 до 95oC. Гранулированный состав содержит микроорганизмы предпочтительно в количестве 0,1-10 вес. %, в частности 0,3-5 вес.%, наиболее предпочтительно 0,5-3,0 вес. % в пересчете на сухое вещество из расчета на 1 кг состава. Сумма всех компонентов гранулированного состава всегда составляет 100%. Плотность популяции в расчете на концентрацию клеток может быть особенно высока. Предпочтительно плотность популяции микроорганизма составляет от 1х105 до 1х1011 КОЕ (колониеобразующих единиц) на грамм гранулированного состава. Во время хранения при комнатной температуре концентрация живых клеток может сохраняться в составе по изобретению в течение периода до 10 месяцев лишь с незначительными потерями микроорганизма, составляющими менее однократного количества на 10 КОЕ. Содержание остаточной воды составляет предпочтительно не менее 1 вес.%, более предпочтительно не менее 3 вес.% и наиболее предпочтительно не менее 5 вес.%. Верхний предел содержания воды предпочтительно составляет не более 40 вес.%, более предпочтительно не более 30 вес.% и наиболее предпочтительно не более 20 вес.%. Верхний предел содержания воды регулируется носителем, водорастворимостью полимера и способом приготовления состава. При нанесении покрытия, например, в псевдоожиженном слое, легко достигается содержание воды, равное 0,5-20 вес.%, в то время как в случае экструзии содержание воды может быть выше и обычно составляет от 0,5 до 40 вес.%. Тонкодисперсный субстрат может иметь частицы со средним размером от 1 мкм до 0,8 см, более предпочтительно от 10 мкм до 0,5 см и наиболее предпочтительно от 20 мкм до 0,2 см. Субстрат может быть неорганическим или органическим материалом. Для грибов предпочтительно использовать органические материалы, а для растительных клеток (бактерий) - неорганические материалы. Типичными примерами водонерастворимых органических материалов являются измельченные отруби, солома, опилки и целлюлоза. Наиболее пригодными неорганическими субстратами являются водонерастворимые окиси металлов и соли металлов (SiO2, Al2O3, BaSO4, CaCO3) или силикаты и алюмосиликаты щелочных металлов и щелочноземельных металлов. Среди силикатов предпочтительны пластинчатые силикаты. Типичными примерами силикатов являются минеральные глины, аттапульгит, кизельгур, порошковая известь, диатомная земля, волластонит, оливин, монтмориллонит и вермикулит. Особенно предпочтителен вермикулит. Количество субстрата обычно составляет от 50 до 99 вес.%, предпочтительно от 65 до 95 вес.% и наиболее предпочтительно от 75 до 90 вес.%. Средний размер частиц гранулированного состава может составлять от 0,01 мм до 8 мм. Предпочтительный средний размер частиц составляет от 0,2 до 4 мм и наиболее предпочтителен средний размер частиц от 0,5 до 2 мм. Пленкообразующий водорастворимый и практически несшитый полимер может быть синтетическим или природным. Типичными примерами синтетических полимеров являются гомо- и сополимеры поливинилового спирта, полиэтиленгликоля или поливинилпирролидона, а также полиакриламиды. Природные полимеры являются в основном полисахаридами, которые могут быть дериватизированы. Существует большое количество известных предпочтительных природных полимеров, и ими обычно являются крахмал, альгинаты, каррагенаны, более предпочтительно k-каррагенан, l-каррагенан,  -каррагенан, ксантан, смола рожкового дерева или метилцеллюлозы. Можно также использовать смеси полимеров. Полимеры должны быть совместимы с микроорганизмом. Совместимость может быть установлена специалистом в данной области техники простым путем посредством соединения микроорганизма и полимера. Особенно предпочтительны альгинаты и каррагенаны. Особенно предпочтительным сочетанием носителя и водорастворимого полимера являются вермикулит с k-каррагенаном. Пленкообразующий, структурно-сшитый набухающий в воде полимер представляет собой полисахарид, предпочтительно k-каррагенан, l-каррагенан, смола рожкового дерева, ксантан или их смесь, которая образуется в присутствии ионов калия. Эти полимеры образуют термообратимые гели, которые характеризуются межмолекулярными водородными связями или ионными связями. Количество растворимого или набухающего в воде полимера может составлять от 0,1 до 20 вес.%, предпочтительно от 0,1 до 10 вес.% и наиболее предпочтительно от 0,5 до 5 вес.%. Мольное соотношение ионов калия и карбоксильных или сульфатных групп полимера составляет от 0,001:1 до 1:1. Микроорганизмы, которые можно использовать для борьбы с вредителями или с болезнями растений в сельском хозяйстве, известны и описаны среди прочего в европейской заявке ЕР-A-0472494. Соответствующими микроорганизмами являются одно- или многоклетчатые грибы или бактерии, обычно включающие Rhizobium spp., Metharizium, Fusarium, Trichoderma, Stryptomyces, Gliocladium, Penicillium, Talaromyces, Verticillium или Colletotrichum. Предпочтительны Pseudomonas spp., Serratia spp., Bacilus spp., Agrobacter spp., Exserohilum spp., Enterobacter spp. Особенно предпочтителен микроорганизм Pseudomonas aurantiaca, ATTC N 55169. Сорняками, насекомыми и грибными заболеваниями, с которыми можно бороться с помощью микроорганизмов, обычно являются Rhizoctonia solani, Rhizoctonia oryzae, Phytium ultimum, Fusarium oxysporum spp., Alphanomyces laevis, Phytophtora infestans, Botrytis spp., Sclerotinia sclerotiorum, Bacillus sp. , Microdochium nivale, Thielaviopsis basicola, Gaeumanomyces graminis и в принципе все другие болезни, вызываемые патогенными микроорганизмами (Erwinia carotovora, Saccharomyces cerevisiae, Xanthomonas vesicatoria, Pseudomonas syringae). Pseudomonas aurantiaca ATTC N 55169 является активным в отношении ряда болезней, указанных выше для различных культур. Особо необходимо отметить защитное действие в отношении Rhizoctonia solani на хлопчатнике, тыквенных культурах, капусте, геранях, бальзамине и пуансеттии. При приготовлении традиционных мелкогранулированных составов (см., например, Connik W. J.: "Formulation of living biological control agents with alginate" в American Chemical Society, ACS Symposium Series 1988, т. 371, стр. 241-250; Fravel D.R., Marois J.J., Lumsden R.D., Connik W.J.: "Encapsulation of potential biocontrol agents in alginate" в Phytopathology, 1985, выпуск 75, стр. 774-777; Stormo K.E., Crawford R.L.: "Preparation of encapsulated microbial cells for environmental application" в Applied and Environmental Microbiology, 1992, стр. 727-730) получают гранулы, которые практически нерастворимы или растворяются только очень медленно даже в буферном растворе, поэтому выделение микроорганизмов происходит очень медленно или не происходит совсем. Неожиданно было установлено, что гранулы, полученные способом по изобретению, обеспечивают очень быстрое выделение микроорганизмов. Состав разлагается в буфере или в воде, что зависит от полимера, в течение от 0,5 до нескольких часов, т.е. полимерный слой отделяется или набухает, благодаря чему все "микробное" содержание выделяется в почву в течение 24 ч. Еще одним объектом изобретения является способ получения гранулированного состава, содержащего тонкоизмельченный субстрат и полимерный слой, содержащий микроорганизмы, причем полимер представляет собой: а) пленкообразующий, водорастворимый и практически несшитый полимер, при этом гранулированный состав содержит не менее 0,5 вес.% воды в пересчете на состав, или б) пленкообразующий структурно-сшитый полисахарид, который содержит карбоксильные или сульфатные группы и набухает в воде в присутствии ионов калия, при этом гранулированный состав содержит не менее 0,5 вес.% воды в пересчете на состав, который включает: (А) для приготовления гранул а) суспендирование или при температуре не выше 95oC растворение пленкообразующего и водорастворимого полимера и суспендирование микроорганизма в этой суспензии или растворе после охлаждения до комнатной температуры, (Б) для приготовления гранул б) суспендирование полисахарида, содержащего карбоксильные группы или сульфатные группы, в водном буферном растворе, содержащем ионы калия, и последующее суспендирование микроорганизма в этом растворе, (В) набрызгивание полученных суспензий непосредственно на тонкоизмельченный субстрат или смешение указанных суспензий с тонкоизмельченным субстратом и (Г) удаление воды до концентрации, которая составляет не менее 0,5 вес.% в пересчете на гранулированный состав. Если суспензия пленкообразующего и водорастворимого полимера используется для получения гранулированного состава а), то эту суспензию предпочтительно готовить при температуре от 10 до 30oC. Для получения раствора пленкообразующего и водорастворимого полимера температура составляет от 25 до 95oC в зависимости от типа полимера. Добавление микроорганизма осуществляют либо к суспензии полимера при температуре ниже 40oC, либо к охлажденному раствору полимера при температуре ниже 40oC, предпочтительно ниже 30oC. Согласно другому варианту способа гранулированный состав б) приготавливают растворением полисахарида, содержащего карбоксильные или сульфатные группы, в водном буферном растворе, содержащем ионы калия, при повышенной температуре, например, 70oC, или растворением таким же способом двух полимеров, которые взаимодействуют друг с другом. Термообратимый гель образуется из этих охлажденных растворов. Добавление микроорганизма производят незадолго до достижения точки затвердевания при температуре ниже 40oC. Буфером может служить любая калийсодержащая соль поливалентной кислоты. Предпочтительны коммерчески доступные фосфатные буферы. В зависимости от отношения первичного кислого фосфата к вторичному кислому фосфату pH устанавливают на уровне примерно 6,5-7,5. Предпочтительное значение pH равно 7,0. Концентрация буфера составляет предпочтительно от 0,00001 М/л до 1 М/л, предпочтительно от 0,005 М/л до 0,05 М/л. Воду удаляют как можно в более мягких условиях, предпочтительно при комнатной или слегка повышенной температуре, достигающей значения вплоть до примерно 35oC. Устройства и методы удаления воды известны. Самый предпочтительный метод зависит от вязкости смеси. Гранулированные составы по изобретению могут быть приготовлены известными методами в обычных устройствах. Метод набрызгивания для смешения компонентов, как правило, используется для нанесения покрытия, обычно в реакторе с псевдоожиженным слоем. По этому методу раствор или суспензию полимера и микроорганизм набрызгивают на субстрат в псевдоожиженном слое и одновременно подвергают сушке. Другой вариант способа представляет собой приготовление новых гранулированных составов известным методом экструзии. Этот метод включает смешение всех компонентов в смесителе с требуемым количеством воды и пропускание смеси через перфорированную пластину. Затем гранулы могут быть измельчены до требуемого размера и высушены. Можно использовать одношнековые экструдеры, грануляторы, субгрануляторы, перфорированные пластины и т.п. Способ по изобретению приводит к получению гранулированного состава, где субстрат покрыт тонким слоем полимера, в котором распределены микрорганизмы. Получаемый продукт обычно представляет собой не отдельные частицы с покрытием, а агломераты, состоящие из множества частиц субстрата неправильной формы. В зависимости от выбранного метода смешения и сушки получают частицы различной формы. Так, процесс экструзии обеспечивает получение цилиндрических гранул, в которых субстрат и микроорганизм содержат покрытие из полимера практически независимо друг от друга, в то время как метод набрызгивания в псевдоожиженном слое приводит к получению агломератов субстрата, в которых частицы покрыты тонким слоем полимера, содержащим микроорганизмы. Эта форма частиц предпочтительна, т. к. из тонкого полимерного слоя происходит чрезвычайно быстрое выделение микроорганизма. Гранулированные составы по изобретению в любом случае являются твердыми легкосыпучими смесями, которые могут использоваться непосредственно как разбрасываемые гранулы. Они просты и безопасны при работе с ними, т.к. их можно загружать непосредственно в механические устройства для применения в поле. Нормы расхода составляют от 1 кг до 20 кг в зависимости от типа микроорганизма. Гранулированные составы по изобретению можно использовать для обработки растений, частей растений либо мест произрастания различных культур (плодов, цветов, листьев, стеблей, клубней, корней, почвы), а сорняки, насекомые-вредители и болезни, встречающиеся у растений, могут быть ингибированы или, соответственно, уничтожены. Обработку мест произрастания растений или самих растений гранулированными составами можно проводить одновременно или последовательно совместно с другими химическими агентами. Такими химическими агентами могут быть удобрения, доноры микроэлементов, а также другие вещества, влияющие на рост растений. Можно использовать селективные гербициды, а также инсектициды, фунгициды, бактерициды, нематоциды, моллюскоциды или их смеси. Изобретение относится также к применению гранулированных составов по изобретению для защиты растений от заражения болезнями или от повреждения насекомыми. Борьба проводится с болезнями сельскохозяйственных культур или декоративных культур в сельском хозяйстве или садоводстве, прежде всего злаков, хлопчатника, овощных культур, винограда, плодовых, масличных культур и цветов. Примерами особенно важных овощных культур являются тыквенные, капуста и бобовые, а цветочных культур - пуансеттия, герани и бальзамины. Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах. Пример A1 10х250 мл бульона Луриа (Luria Broth), инокулированного Pseudomonas aurantiaca, АТТС N 55169, по завершении 16-часового роста клеток центрифугируют в шейкере и осадок ресуспендируют в 0,01 М фосфатном буфере (K2HPO4: KH2PO4 = 1:0,78, pH 7) до концентрации 40 мл. 100 мл фосфатного буфера нагревают до 70oC и добавляют 0,7 г k-каррагенана до получения 0,7%-ного раствора k-каррагенана в 0,01 М фосфатном буфере. Раствор охлаждают до температуры, немного превышающей точку затвердевания, и смешивают с суспензией микроорганизмов. Затем эту смесь распыляют в псевдоожиженном слое над 100 г вермикулита, получая гранулированную композицию следующего состава: 16% остаточной воды; 1,5% микроорганизмов, в виде сухого вещества; 81,9% вермикулита; 0,6% k-каррагенана. Начальная концентрация равна примерно 1,1 1010 КОЕ/г (колониеобразующих единиц). Для достижения стабильности при хранении через соответствующие интервалы времени определяют концентрацию. Получают данные, приведенные в табл. 1. Пример A2 5 г k-каррагенана смешивают с 40 г 0,01 М фосфатного буфера. Затем добавляют 10 г дебриса (30% сухого вещества) Pseudomonas aurantiaca, АТТС N 55169, полученных в 50-литровом ферментере. Полимер вместе с микроорганизмами одновременно смешивают со 120 г вермикулитного порошка и затем экструдируют. Полученные гранулы сушат в псевдоожиженном слое до требуемого содержания воды. Гранулированная композиция имеет следующий состав: 18% остаточной воды; 1,8% микроорганизмов, в виде сухого вещества; 77% вермикулита; 3,2% k-каррагенана. Начальная концентрация составляет примерно 3,31010 KOE/г (см. табл. 2). Пример A3 250 мл бульона Луриа, инокулированного Pseudomonas aurantiaca, ATTC N 55169, после 16-часового выращивания клеток центрифугируют в шейкере, осадок ресуспендируют в 0,01 М фосфатном буфере аналогично примеру 1 до концентрации 40 мл. Суспензию микроорганизмов смешивают со 100 мл 3%-ного раствора альгината натрия в 0,01 М фосфатном буфере аналогично примеру 2 и распыляют в псевдоожиженном слое над 100 г вермикулита. Получают гранулированную композицию следующего состава: 12% остаточной воды; 0,5% микроорганизмов, в виде сухого вещества; 85,5% вермикулита; 2,5% альгината натрия. Начальная концентрация составляет примерно 7,6108 КОЕ/г (см. табл. 3). В примерах A4 и A5 используют спонтанный мутант Pseudomonas aurantiaca, ATTC N 55169. Мутант получают следующим образом: Pseudomonas aurantiaca, ATTC N 55169, высевают на чашку с агаром Луриа, содержащим 0,00005% рифампицина, и выделяют известным методом спонтанно резистентные мутанты, которые культивируют далее. Полученные таким образом рифампицин-резистентные мутанты используют в последующих экспериментах примеров A4 и A5. Пример A4 250 мл бульона Луриа, инокулированного Pseudomonas aurantiaca, АТТС N 55169, (рифампицин-резистентного), после 16-часового выращивания клеток центрифугируют в шейкере, осадок ресуспендируют в 0,01 М фосфатном буфере до содержания 42 г аналогично примеру 1. Суспензию микроорганизмов смешивают с таким же количеством раствора поливинилового спирта (Mowiol 40-88, 16%) и распыляют в псевдоожиженном слое над 100 г вермикулита. Получают гранулированную композицию следующего состава: 10% остаточной воды; 0,5% микроорганизмов, в виде сухого вещества; 84% вермикулита; 5,5% поливинилового спирта. Начальная концентрация составляет примерно 1,1109 КОЕ/г (см. табл. 4). Пример A5 250 мл бульона Луриа, инокулированного Pseudomonas aurantiaca, АТТС N 55169, (рифампицин-резистентного), после 16-часового выращивания клеток центрифугируют в шейкере, осадок ресуспендируют в 0,01 М фосфатном буфере до концентрации 40 мл аналогично примеру 1. Суспензию микроорганизмов смешивают со 100 мл 3%-ной суспензии k-каррагенана в 0,01 М фосфатном буфере аналогично примеру 2 и распыляют над 100 г вермикулита. Получают гранулированную композицию следующего состава: 12% остаточной воды; 0,5% микроорганизмов, в виде сухого вещества; 85% вермикулита; 2,5% k-каррагенана. Начальная концентрация равна примерно 1,1 109 КОЕ/г (см. табл. 5). Пример A6 8 г l-каррагенана смешивают с 40 мл 0,01 М фосфатного буфера. Затем добавляют 5 г центрифугированных спор Fusarium nygamai, ферментированных в 50-миллилитровом ферментере со средой Ричарда в течение 120 ч. Смесь полимера с микроорганизмами смешивают до гомогенности со 120 г порошкообразного вермикулита и экструдируют. Полученный гранулированный состав сушат в псевдоожиженном слое до требуемого содержания воды. Получают гранулированную композицию следующего состава: 13% остаточной воды; 0,5% микроорганизмов, в виде сухого вещества; 81% вермикулита; 5,5% l-каррагинана. (Далее см. табл. 6). Пример В1: Биологические испытания Гранулированный состав, приготовленный согласно примеру 1, испытывают на его биологическую активность после хранения в течение различных промежутков времени при комнатной температуре в тепличных условиях. Стандартизованные условия испытаний являются следующими: культура:хлопчатник; патоген: Rhizoctonia solani. Гранулированный состав вносят в горшечную почву в количестве 16 г/л горшечной почвы. При хранении в течение 10 месяцев при комнатной температуре не наблюдается потери биологической активности.
Формула изобретения1. Гранулированный состав, включающий тонкодисперсный субстрат и полимерный слой, содержащий микроорганизмы, причем полимер представляет собой а) пленкообразующий, водорастворимый и практически несшитый полимер, при этом гранулированный состав содержит не менее 0,5 вес.% воды в пересчете на состав, или б) пленкообразующий структурно-сшитый полисахарид, который содержит карбоксильные или сульфатные группы и набухает в воде в присутствии ионов калия, при этом гранулированный состав содержит не менее 0,5 вес.% воды в пересчете на состав. 2. Гранулированный состав по п.1, который содержит микроорганизмы в количестве от 0,1 до 10 вес.% из расчета на 1 кг состава. 3. Гранулированный состав по п.1, который содержит микроорганизмы в количестве от 0,3 до 5 вес.% из расчета на 1 кг состава. 4. Гранулированный состав по п.1, который содержит микроорганизмы в количестве от 0,5 до 3 вес.% из расчета на 1 кг состава. 5. Гранулированный состав по п. 1, который содержит микроорганизмы с плотностью популяции от 1 105 до 1 1011 КОЕ (колониеобразующих единиц) на 1 г состава. 6. Гранулированный состав по п.1, в котором содержание остаточной воды составляет не менее 1 вес.% в пересчете на состав. 7. Гранулированный состав по п.1, в котором содержание остаточной воды составляет не менее 3 вес.% в пересчете на состав. 8. Гранулированный состав по п.1, в котором содержание остаточной воды составляет не менее 5 вес.% в пересчете на состав. 9. Гранулированный состав по п.1, в котором максимальное содержание воды составляет не более 40 вес.% в пересчете на состав. 10. Гранулированный состав по п. 1, в котором средний размер частиц тонкодисперсного субстрата составляет от 1 мкм до 0,8 см. 11. Гранулированный состав по п. 1, в котором средний размер частиц тонкодисперсного субстрата составляет от 10 мкм до 0,5 см. 12. Гранулированный состав по п. 1, в котором средний размер частиц тонкодисперсного субстрата составляет от 20 мкм до 0,2 см. 13. Гранулированный состав по п.1, в котором водонерастворимый субстрат представляет собой неорганический или органический материал. 14. Гранулированный состав по п.13, в котором водонерастворимый субстрат представляет собой измельченные отруби, солому, древесную пыль или целлюлозу. 15. Гранулированный состав по п.13, в котором неорганический субстрат представляет собой водонерастворимую окись металла, соль металла (SiO2, Al2O3, BaSO4, CaCO3), силикат или алюмосиликат щелочных и щелочноземельных металлов. 16. Гранулированный состав по п.15, в котором водонерастворимый субстрат представляет собой минеральную глину, аттапульгит, кизельгур, порошковую известь, диатомовую землю, волластонит, оливин, монтмориллонит или вермикулит. 17. Гранулированный состав по п.15, в котором водонерастворимый субстрат представляет собой вермикулит. 18. Гранулированный состав по п.1, в котором количество субстрата составляет 50 - 99 вес.% в пересчете на состав. 19. Гранулированный состав по п.18, в котором количество субстрата составляет 65 - 95 вес.% в пересчете на состав. 20. Гранулированный состав по п.1, в котором количество субстрата составляет 75 - 90 вес.% в пересчете на состав. 21. Гранулированный состав по п.1, в котором средний размер частиц составляет от 0,01 до 8 мм. 22. Гранулированный состав по п.21, в котором средний размер частиц составляет от 0,2 до 4 мм. 23. Гранулированный состав по п.21, в котором средний размер частиц составляет от 0,5 до 2 мм. 24. Гранулированный состав по п.1, в котором пленкообразующим, водорастворимым и практически несшитым полимером является синтетический или природный полимер. 25. Гранулированный состав по п. 1, в котором пленкообразующим водорастворимым и практически несшитым полимером является гомополимер или сополимер поливинилового спирта, полиэтиленгликоля или поливинилпирролидона, а также полиакриламиды. 26. Гранулированный состав по п. 1, в котором пленкообразующим водорастворимым и практически несшитым полимером является полисахарид или его производное. 27. Гранулированный состав по п.26, в котором пленкообразующим водорастворимым и практически несшитым полимером являются крахмал, альгинат, каррагенан, k-каррагенан, l-каррагенан, ксантан, смола рожкового дерева или метилцеллюлоза либо их смеси. 28. Гранулированный состав по п.27, в котором пленкообразующим водорастворимым и практически несшитым полимером являются k-каррагенан, l-каррагенан или альгинат. 29. Гранулированный состав по п.1, в котором пленкообразующим структурно-сшитым набухающим в воде полимером, содержащим карбоксильные или сульфатные группы, является k-каррагенан, l-каррагенан, ксантан или смесь смолы рожкового дерева и ксантана. 30. Гранулированный состав по п.1, в котором пленкообразующим структурно-сшитым набухающим в виде полимером, содержащим карбоксильные или сульфатные группы, является k-карроагенан, l-каррагенан. 31. Гранулированный состав по п.1, который содержит водорастворимый или набухающий в воде полимер в количестве от 0,1 до 20 вес.% в пересчете на состав. 32. Гранулированный состав по п.1, в котором молярное соотношение между ионами калия и карбоксильными или сульфатными группами полимера составляет от 0,001 : 1 до 1 : 1. 33. Гранулированный состав по п.1, в котором микроорганизм выбирают из группы, состоящей из Rhizobium spp., Metharizium, Fusarium, Trichoderma, Streptomyces, Gliocladium, Penicillum, Talaromyces, Verticillium или Colletotrichum, Pseudomonas spp., Serratia spp., Exserohilum spp., Bacillus spp., Agrobacter spp., Enterobacter spp. и Pseudomonas aurantiaca ATTC N 55169. 34. Гранулированный состав по п.1, в котором микроорганизмом является Pseudomonas aurantiaca ATTC N 55169. 35. Способ приготовления гранулированного состава, включающего тонкодисперсный субстрат и полимерный слой, содержащий микроорганизмы, причем полимер представляет собой а) пленкообразующий, водорастворимый и практически несшитый полимер, при этом гранулированный состав содержит не менее 0,5 вес. % воды в пересчете на состав, или б) пленкообразующий структурно-сшитый полисахарид, который содержит карбоксильные или сульфатные группы и набухает в воде в присутствии ионов калия, при этом гранулированный состав содержит не менее 0,5 вес.% воды в пересчете на состав, который включает (А) для приготовления гранул а) суспендирование либо при температуре не выше 95oС растворение пленкообразующего и водорастворимого полимера и суспендирование микроорганизма в этой суспензии или растворе после охлаждения до комнатной температуры, (Б) для приготовления гранул б) суспендирование полисахарида, содержащего карбоксильные группы или сульфатные группы, в водном буферном растворе, содержащем ионы калия, и последующее суспендирование микроорганизма в этом растворе; (В) набрызгивание полученных суспензий непосредственно на тонкодисперсный субстрат или смешение указанных суспензий с тонкодисперсным субстратом и (Г) удаление воды до концентрации не менее 0,5 вес.% в пересчете на гранулированный состав. 36. Способ по п.35, в котором в случае использования для приготовления гранулированного состава а) суспензии пленкообразующего и водорастворимого полимера эту суспензию получают предпочтительно при температуре от 10 до 30oС. 37. Способ по п.35, в котором в случае использования для приготовления гранулированного состава а) раствора пленкообразующего и водорастворимого полимера этот раствор получают предпочтительно при температуре от 25 до 95oС. 38. Способ по п.35, в котором микроорганизм добавляют при температуре менее 40oС к раствору или суспензии полимера. 39. Способ по п.35, в котором микроорганизм добавляют при температуре менее 30oС. 40 Способ по п.35, в котором буфер представляет собой смесь первичного кислого фосфата калия и вторичного кислого фосфата калия. 41. Способ по п.40, в котором рН раствора или суспензии составляет 7. 42. Способ по п.39, в котором концентрация буфера составляет от 0,00001 до 1 М/л. 43. Гранулированный состав по пп.1 - 34, отличающийся тем, что он обладает инсектицидной и фунгицидной активностью.
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе Дата прекращения действия патента: 04.07.2002 Извещение опубликовано: 20.11.2004 БИ: 32/2004 Популярные патенты: 2271092 Сортировка барабанного типа ... и государственных хозяйствах. Формула изобретения 1. Сортировка барабанного типа, содержащая спиральный каркас, сортирующий рабочий орган в виде гибкой эластичной ячеистой сетки, образующей отдельные сортирующие секции путем провисания сетки между соседними витками спирального каркаса, при этом размер ячеек сетки увеличивается по направлению перемещения продукта от места подачи в спиральный каркас, отводящие лотки для отсортированных фракций, расположенные под ячеистой сеткой, и приемный лоток, отличающаяся тем, что на раме посредством подшипников установлен вал со спиральным каркасом, на витках которого закреплен сменный сортирующий рабочий орган, причем выходная кромка ... 2210910 Способ обработки растений и используемая в нём композиция для защиты растений ... композицией, содержащей, по меньшей мере, одно токсичное вещество и целевые добавки, согласно изобретению, в составе целевых добавок используют препарат, полученный путем последовательного экстрагирования биомассы микромицета Mortierella nigrescens неполярным экстрагентом в надкритическом состоянии, водой, щелочью, водой, кислотой, водой, щелочью и водой с последующим объединением первого экстракта с твердым остатком, в количестве 0,1-20 мг/га посадки или 0,5-10000 мг/т посевного материала в пересчете на суммарное содержание хитозана, арахидоновой и эйкозапентаеновой кислот. Этот же результат достигается тем, что композиция для защиты растений, содержащая, по меньшей мере, одно ... 2195644 Монитор для определения качества зерна ... отраженного от облученного исследуемого участка; разделения по длинам волн собранного отраженного излучения для получения пространственно разделенных потоков излучения с различными длинами волн; помещения шторки 47 оптического блока в закрывающее 101 или в открывающее 103 положение для селективного формирования фонового спектра сравнения и детектирования сигналов интенсивности от пространственно разделенных потоков излучения с множеством выбранных длин волн для определения множества значений интенсивности излучения. 13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что дополнительно включает шаг смешивания мод излучения, принятого на шаге сбора излучения, для сглаживания изменений ... 2289908 Способ получения рассады стевии ... Приживаемость черенков стевии составила на 12 день 91%.Контроль. Все условия те же, но посадка свежесрезанных черенков стевии проводилась в рассадочные ящики по схеме 2×3 см. Приживаемость черенков на 12 день составила 42%. Срок получения готовой рассады 28-30 дней.Таким образом, проведение опытов по способу получения рассады стевии по примерам 2, 3 наиболее оптимальны, т.к. приживаемость черенков составляет 98-99% при влажности почвенного субстрата 75-80%, среднесуточной температуре 20-23°С, относительной влажности воздуха 65-70%, а срок получения рассады стевии в течение 24-25 дней.Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими ... 2470922 Сокристаллы ... ПРИМЕРЫ1. Получение сокристаллов ципродинила и бензойной кислоты4 г ципродинила (форма B) и 2,4 г бензойной кислоты добавляли к 200 мл изогексана, находящегося при 60°C в круглодонной колбе; вещества немедленно растворялись и раствор выдерживали при перемешивании при 60°C в течение 30 мин. Раствор охлаждали со скоростью 10°C/час до 25°C и выдерживали при 25°C в течение ночи. Продукт (игольчатые кристаллы белого цвета) отделяли фильтрованием. 4 г ципродинила (форма B) и 2,4 г бензойной кислоты добавляли к 250 мл изогексана, находящегося при 60°C в круглодонной колбе; вещества немедленно растворялись и раствор выдерживали при перемешивании при ... |
Еще из этого раздела: 2404581 Способ изготовления муляжей анатомических препаратов полых и трубчатых органов 2086081 Рабочий орган культиватора 2050099 Косилка с всасывающим устройством 2110911 Способ выращивания птицы 2242875 Энергосберегающий способ зимовки и содержания пчел на воле в однокорпусном улье усова 2162635 Устройство для аэрозольного распыления (варианты) 2455815 Самоходный универсальный комбайн для уборки картофеля и топинамбура 2275804 Способ повышения продуктивности птицы 2451442 Способ обогащения селеном овощей и злаков 2161391 Комбинированная почвообрабатывающая посевная машина |
Изобретения в сельском хозяйстве
Обработка почвы в сельском и лесном хозяйствах
Посадка, посев, удобрение
Уборка урожая, жатва
Обработка и хранение продуктов полеводства и садоводства
Садоводство, разведение овощей, цветов, риса, фруктов, винограда, лесное хозяйство
Новые виды растений или способы их выращивания
Производство молочных продуктов
Животноводство, разведение и содержание птицы, рыбы, насекомых, рыбоводство, рыболовство
Поимка, отлов или отпугивание животных
Консервирование туш животных, или растений или их частей
Биоцидная, репеллентная, аттрактантная или регулирующая рост растений активность химических соединений или препаратов
Хлебопекарные печи, машины и прочее оборудование для хлебопечения
Машины или оборудование для приготовления или обработки теста
Обработка муки или теста для выпечки, способы выпечки, мучные изделия
|
|
||