Способ изготовления костного аллотрансплантата

Международная патентная классификация:       A01N

Патент на изобретение №:      2147800

Автор:      Лекишвили М.В., Касымов Ильгар Абульфас оглы

Патентообладатель:      Центральный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им.Н.Н.Приорова, Лекишвили Михаил Васильевич, Касымов Ильгар Абульфас оглы

Дата публикации:      27 Апреля, 2000

Начало действия патента:      17 Февраля, 1999

Адрес для переписки:      125299, Москва, ул.Приорова 10, ЦИТО им.Н.Н.Приорова, лаборатория "Костный банк", Лекишвили М.В.

Изобретение относится к медицине. Способ изготовления костного аллотрансплантата может быть использован в травматологии, ортопедии и других областях восстановительной хирургии для осуществления костной пластики. Способ включает проведение механической обработки и промывки заготовки из костного материала, выполнение в ней сквозных отверстий, деминерализацию в растворе соляной кислоты, консервацию деминерализованной заготовки с помощью лиофильной сушки, стерилизацию после окончания сушки, осуществляемую путем облучения заготовки, помещенной в герметичную упаковку, пучком ускоренных электронов дозой 15-18 кГр в течение 16-20 с. Способ обеспечивает повышение качества аллотрансплантата. 1 с. и 3 з.п. ф-лы.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

Изобретение относится к медицине, а именно к ортопедии, травматологии и другим областям восстановительной хирургии, и может быть использовано при заготовке костных трансплантатов, предназначенных для осуществления костной пластики.

Известен способ изготовления аллотрансплантата, который заключается в последовательно проводимых механической очистке полученной от донора заготовки из костной ткани, обработке ее раствором перекиси водорода, стерилизации парами формалина, размещении в герметизируемые стеклянные ампулы, замораживании в холодильной камере при температуре минус 70oC и хранении заготовленного трансплантата до его клинического использования при температуре минус 30oC (см. кн: Имамалиев А.С. Биологическая оценка трансплантируемых тканей. М.: Наука, 1975 г., с. 48-57 [1]).

Полученный по способу [1] замороженный кортикальный аллотрансплантат отличается высокой механической прочностью, но не обладает, однако, заметными остеоиндуктивными свойствами, не обеспечивая при клиническом использовании быстрой перестройки и высокой регенерации костной ткани в области пересадки.

Известен способ изготовления аллотрансплантата, включающий механическую обработку полученной от донора заготовки из костного материала, промывку ей холодной водой, деминерализацию в 1,2-3,6 н. растворе соляной кислоты, промывку деминерализованной заготовки в дистилляте и в физиологическом растворе, стерилизацию и консервацию заготовки путем размещения и выдерживания ее в соответствующей герметичной таре (упаковке), залитой раствором формалина с добавкой антибиотика, (см.: Савельев В.И. Деминерализованная кость как особая разновидность костно-пластического материала. Сборник научных трудов ЛНИИТО им Р.Р. Вредена. Заготовка и пересадка деминерализованной костной ткани в эксперименте и клинике. Л.:НИИТО, 1983, с. 3-12 [2]).

Известный из [2] способ позволяет за счет деминерализации костной ткани получать аллотрансплантаты с высокой остеоиндуктивностью (которой практически не обладают замороженные недеминерализованные трансплантаты, приготовленные по способу [1]) и низкой антигенностью.

По совокупности существенных признаков известный из [2] способ является наиболее близким аналогом заявленного изобретения.

Однако существенным недостатком полученных по способу-прототипу [2] аллотрансплантатов является легко возникающая их деформация и низкая механическая точность, что недопустимо при обширных, и, в особенности, при сегментарных резекциях, требующих дополнительно наличия металлических конструкций, в то время как при использовании кортикальных, замороженных трансплантатов по способу [1] имеется возможность использовать гипсовую иммобилизацию.

Использование в [2] формалина в качестве консерванта и стерилизатора влечет за собой ряд проблем, обусловленных ограничением времени хранения трансплантата (не более 6-й месяцев), необходимостью отмывки приготовленного трансплантата перед клиническим использованием, токсичностью формалина, а также неудобством хранения и транспортировки трансплантата, погруженного в раствор формалина.

Кроме того, используемая в [2] достаточно высокая концентрация соляной кислоты не позволяет надежно контролировать интенсивно протекающий процесс деминерализации, что может привести к снижению качества деминерализации, а следовательно, и к снижению остеоиндуктивного свойства полученного трансплантата.

Задачей заявленного изобретения является повышение качества аллотрансплантата и улучшение его эксплуатационных свойств за счет повышения механической прочности, улучшения остеоиндуктивных свойств, увеличения срока хранения, упрощения и сокращения времени подготовки аллотрансплантата к клиническому использованию.

Для решения поставленной задачи способ изготовления костного аллотрансплантата, включающий последовательно проводимые механическую обработку и промывку взятой от донора заготовки из костного материала, ее деминерализацию в растворе соляной кислоты, а также стерилизацию, консервацию и герметизацию заготовки, усовершенствован согласно данному изобретению тем, что перед деминерализацией в заготовке выполняют множественные сквозные отверстия, консервацию проводят посредством лиофильной сушки, а стерилизацию осуществляют после окончания лиофильной сушки с помощью облучения заготовки, помещенной перед ее стерилизацией в герметичную упаковку, пучком ускоренных электронов в течение 16-20 сек дозой облучения 15-18 кГр.

Кроме того, способ изготовления костного аллотрансплантата усовершенствован тем, что лиофильная сушка заготовки из костного материала включает замораживание ее в течение 22-26 часов до температуры в интервале от минус 60 до минус 80oС, выдерживание заготовки в течение 3-5 суток при температуре в интервале от минус 30 до минус 40oС и снижение влажности костного материала до 4-6% в течение 30-40 часов при постепенном увеличении температуры сушки в течение первых 6-8 часов сушки до 35-45oС и сохранении этой температуры до окончания процесса лиофильной сушки.

Кроме того, тем, что деминерализацию проводят в (0,7-1,1) н. растворе соляной кислоты при 18-20oС в течение 2-3 суток.

А также тем, что диаметр множественных отверстий в заготовке составляет 0,6-0,8 мм при плотности расположения отверстий 19-1,5 отверстия на кв.см поверхности заготовки.

Предложенные согласно заявленному изобретению усовершенствования способа изготовления аллотрансплантата являются результатом обобщения данных лабораторных исследований и практики клинического использования аллотрансплантатов, изготовленных с использованием вышеуказанных усовершенствований - новых, по отношению к способу-прототипу, действий, условий их выполнения и режимных параметров, при которых они выполняются. Полученные результаты лабораторных испытаний и клинического использования подтверждают возможность решения поставленной в заявленном изобретении задачи.

В частности, предложенная консервация заготовок из костного материала путем лиофильной (сублимационной) сушки позволяет повысить механическую прочность трансплантатов, увеличить срок их хранения без потери ими биологических свойств, упростить их подготовку к клиническому использованию, исключить необходимость использования формалина в процессе изготовления аллотрансплантатов и связанные с этим проблемы (в том числе и экологическую), а также обеспечить удобство транспортировки и хранения трансплантатов.

Вышеприведенные заявленные временные, влажностные и температурные режимные параметры лиофильной сушки в наибольшей мере позволяют реализовать все ей преимущества применительно к процессу изготовления аллотрансплантата. При этом предложенное замораживание заготовки в течение 22-26 часов при температуре в интервале от минус 60 до минус 80oС обеспечивает быстрое замораживание костного материала заготовки с переходом жидкости костной ткани непосредственно в аморфное состояние, минуя стадию кристаллизации, что позволяет сохранить целостность клеток костной ткани, сохранить костную ткань в биологически активном состоянии и снизить тем самым риск отторжения используемого трансплантата.

Выдерживание заготовки в процессе сушки при температуре в интервале от минус 30 до минус 40oС в течение 3-5 суток и последующее снижение влажности костной ткани вышеуказанным образом способствует в наибольшей степени разрушению антигенных структур и сохранению костного морфогенетического белка в состоянии готовности к взаимодействию с индуцибельными системами, т.е. обеспечивает высокие остеоиндуктивные свойства аллотрансплантата.

Для лиофильной сушки заготовки с реализацией вышеуказанных режимов температур может быть использована, например, сублимационная установка типа LZ-9.2 (изготовитель установки - фирма "ФРИГЕРА", г. Колин, ЧССР).

Выполнение множественных сквозных отверстий в заготовке, по ее толщине, в процессе изготовления аллотрансплантата дает возможность при клиническом применении интенсифицировать процесс его замещения новообразованной костной тканью, при котором эти отверстия быстро заполняются соединительной тканью, постепенно трансформируемой в хрящевую ткань, чья резорбция сопровождается заполнением отверстий трабекулярной костью, костным мозгом. Таким образом, отверстия в деминерализованном трансплантате дополнительно стимулируют остеогенез, являясь множественными локализованными его центрами.

Предложенный размер сквозных отверстий 0,6-0,8 мм является, как показали результаты исследований, оптимальным с точки зрения интенсивности замещения трансплантата новообразованной костной тканью, при этом плотность равномерно распределенных отверстий, составляющая 1-1,5 отверстия на кв.см поверхности заготовки, обеспечивает, при повышении активности остеогенеза, механическую прочность трансплантата.

Предложенная деминерализация заготовки в (0,7-1,1) н. растворе соляной кислоты в течение 2-3 суток при температуре 18-20oС позволяет, при наличии в заготовке множественных отверстий, обеспечить активность процесса деминерализации костной ткани, дает возможность более надежно контролировать этот процесс и снизить при этом расход кислоты на деминерализацию.

В отношении стерилизации заготовки в данном изобретении путем ее облучения пучком ускоренных электронов необходимо отметить, что такое решение позволяет надежно уничтожать бактерии, споры и вирусы, сохраняя костный морфогенетический белок в активном состоянии, причем процесс стерилизации ускоренными электронами по сравнению со стерилизацией формалином в способе-прототипе характеризуется быстротой (16-20 сек), простотой, низкой трудоемкостью, экологичностью. Для стерилизации могут быть использованы, например, отечественные промышленные ускорители электронов: типа ЛУЭ-8-5М (изготовитель - Ленинградский завод им. Ефремова) или типа У003МВ (изготовитель - московский завод "Торий"), позволяющие создавать пучок электронов с энергией 8-9 МэВ, обеспечивая предельную мощность дозы облучения порядка 1-1,2 кГр/сек.

Необходимая для наиболее эффективной стерилизации доза облучения составляет, как показали опыты, 15-18 кГр при оптимальном (с точки зрения сохранения активности костного морфогенетического белка) времени облучения помещенной в упаковку заготовки - 16-20 сек.

Пример осуществления способа. Из полученного от донора фрагмента бедренной кости (кортикальная кость диафиза бедра) выпиливают заготовку длиной 25 см, шириной 2 см и толщиной 0,5 мм. Проводят ее механическую обработку путем удаления мягких тканей и миелоидно-жирового костного мозга. Помещают заготовку в 3%-ный раствор перекиси водорода на 1 час для удаления компонентов крови из компактного слоя.

Далее в заготовке сверлят множественные сквозные отверстия диаметром 0,8 мм (при этом на кв. см поверхности заготовки общей площадью 25х2 кв.см приходится одно отверстие), после чего заготовку на 54 часа помещают в 1,1 н. раствор соляной кислоты при 18oС. Степень деминерализации, контролируемая рентгенологическим и морфометрическим методами, составляет по окончании процесса 50%. Соляную кислоту отмывают из заготовки раствором тиосульфата натрия, троекратно погружая ее в раствор на 35 мин.

Затем заготовку замораживают в течение 24 часов в холодильной камере при температуре минус 70oС. После этого заготовку помещают в сушильную камеру сублимационной установки типа LZ-9.2 (позволяющей, следует заметить, одновременно лиофилизировать 30-40 заготовок аллотрансплантата) на охлаждаемую полку-пластину, вакуумируют камеру (создают в ней разрежение), выдерживают заготовку 3-е суток при температуре минус 35oС. Затем в течение 7 часов, поддерживая в камере разрежение и нагревая полку с использованием регулируемого электронагрева, постепенно увеличивают температуру сушки до 40oС, сохраняя такую температуру в течение 28 часов до достижения конечной влажности костной ткани 5%.

После окончания сушки заготовку помещают в пластиковый герметичный пакет и облучают пучком ускоренных электронов в течение 18 сек результирующей дозой 16 кГр. Облучение проводится посредством двух ускорителей электронов типа ЛУЭ-8-5М. В таком виде аллотрансплантат готов к использованию в пластической операции и может храниться при температуре 18-20oС до 5 лет.

Перед клиническим использованием аллотрансплантат, после вскрытия упаковки, выдерживается в физиологическом растворе и/или растворе антибиотика в течение 15-20 мин, после чего приобретает необходимые для аллопластики упругие и пластические свойства.

Пример на клиническое использование.

Больная С. , 8 лет, и.б. N 439. Диагноз: неостеогенная фиброма верхней трети левой большой берцовой кости. Болеет около 10 месяцев, жалобы на периодические боли в верхней трети левой голени. На рентгенограмме обнаружен патологический очаг в верхней трети большой берцовой кости. Госпитализирована 24.02.98 в клинику ЦИТО. 03.03.98 под наркозом произведена операция: краевая резекция кости, удаление патологического очага, произведена аллопластика (с использованием трансплантатов, изготовленных в соответствии с заявленным изобретением) по типу "вязанки хворостом". Послеоперационный период протекал гладко. Рана зажила первичным натяжением. На 12-е сутки после операции сняты швы. Фиксация конечности осуществлялась 2 месяца гипсовой повязкой.

В динамическом наблюдении через 3 месяца была отмечена перестройка трансплантатов и регенерация в области дефекта. Через 9 месяцев на рентгенограммах отмечена полная органотипическая перестройка зоны дефекта, жалоб нет. В настоящее время С. живет обычной жизнью, без ограничений.

Аллотрансплантаты, изготовленные по предложенному способу, применены, в частности, в клинике детской костной патологии и подростковой ортопедии ЦИТО им. Н. Н. Приорова при оперировании 70 детей с опухолями, опухолеобразными поражениями и дисплазиями костей. При этом в зависимости от решаемой посредством костной пластики задачи были использованы трансплантаты из кортикальной кости длиной от 5 до 25 см, шириной от 1,5 до 2,5 см и толщиной от 0,4 до 0,6 мм. Ни в одном из случаев не было отмечено отторжение или нагноение трансплантатов, что свидетельствует о его высоких пластических свойствах.

Клиническая тактика подтверждает также и отмеченные выше качества аллотрансплантатов, изготовленных по заявленному способу: высокая остеоиндуктивная активность при пересадке и низкая антигенность.

Перечисленные выше качества, обеспечиваемые предложенным способом приготовления трансплантатов, позволяют в клинической практике сократить сроки лечения больных и резко снизить процент отторжения, что избавит пациентов от неоднократных оперативных вмешательств и психических травм.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ изготовления костного аллотрансплантата, включающий механическую обработку и промывку заготовки из костного материала, ее деминерализацию в растворе соляной кислоты, нейтрализацию остатков в ней соляной кислоты, стерилизацию, консервацию и герметизацию деминерализованной заготовки, отличающийся тем, что перед деминерализацией в заготовке выполняют множественные сквозные отверстия, консервацию деминерализованной заготовки проводят с помощью лиофильной сушки, а стерилизацию осуществляют после окончания лиофильной сушки путем облучения заготовки, помещенной в герметичную упаковку, пучком ускоренных электронов дозой 15 - 18 кГр в течение 16 - 20 с.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что лиофильная сушка заготовки включает замораживание ее в течение 22 - 26 ч до температуры в интервале от (-60) - (-80)oC, выдерживание заготовки в течение 3 - 5 сут при температуре в интервале от (-30) - (-40)oC и снижение влажности костного материала заготовки до 4 - 6% в течение 30 - 40 ч, при постепенном увеличении температуры сушки в течение первых 6 - 8 ч сушки до 35 - 40oC и сохранении этой температуры до окончания процесса сушки.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что деминерализацию заготовки проводят в (0,7 - 1,1) н. растворе соляной кислоты при температуре 18 - 20oC в течение 2 - 3 сут.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в заготовке выполняют сквозные отверстия диаметром 0,6 - 0,8 мм при плотности их расположения на поверхности заготовки отверстия 1 - 1,5 см2.

Популярные патенты:

2278488 Способ создания пастбищных экосистем весенне-летнего срока использования

... декаде февраля - первой декаде марта. Семена кустарников и полукустарников высевают в рядки с шириной междурядий 0,7 м на глубину до 0,5 см. Семена травянистых растений высевают в междурядья полукустарников на глубину 1÷3 см. При ремонте пастбищных экосистем весенне-летнего срока пользования при снижении плотности травостоя пастбищных агрофитоценозов до 60÷65% к исходным показателям в ноябре-декабре производят прямой подсев семян аридных кормовых растений из расчета 30÷35% от первоначальной нормы. На отремонтированных участках долголетних пастбищ стравливание растительной массы проводят с осени следующего года. Изобретение позволяет повысить устойчивость и ...

2422377 Биоцидный концентрат

... патентоспособности. Предложенный биоцидный концентрат кластеров наночастиц серебра стимулирует иммунную систему, стабилизирует обмен веществ в организме и обезвреживает более 650 видов вредных бактерий и вирусов (для сравнения: спектр действия любого химического антибиотика составляет 5-10 видов).Наночастицы в наводненной оболочке ассоциатов воспринимаются клетками человеческого организма как природный биосовместимый компонент. Биоцидный концентрат может использоваться без разбавления для аппликаций на пораженные участки кожи.Модифицированный хитозаном серебряный концентрат глубоко очищает кожу, снимает воспаления, поддерживает водно-жировой баланс, препятствует аллергическим ...

2423036 Биоконтейнер для посадки растений

... абсорбента, т.е. та площадь, с которой при недостатке влаги в почве будет происходить влагоотдача корням растений.В том случае, если в состав используемого набухающего биоразлагаемого в почве абсорбента воды или водных растворов входят полисахариды и/или их производные, достигается оптимальная скорость биоразложения абсорбента в почве. Этим обеспечивается возможность усвоения продуктов биоразложения абсорбента растением уже в текущем цикле вегетации.Ниже приводятся примеры, иллюстрирующие результаты применения биоконтейнеров, выполненных в соответствии с заявленным изобретением, при посадке различных растений.Пример 1. Из партии семян огурцов одного сорта отобрали 200 однородных по ...

2175177 Агромост с оснасткой для прокладки и уплотнения постоянных грунтовых колей

... перпендикулярную ферме 1, ставят агромост в исходное положение, при котором середина катка 8 должна находиться над проволокой 37, и такое же положение над проволокой должен занимать свободный конец одной из трубчатых штанг 13, 14, находясь над проволокой на высоте в 10-20 см. Затем домкратами 12 опускают на грунт катки 8, 9, 10 и начинают движение агромоста по агроугодью, наблюдая из кабины, чтобы конец трубчатой штанги двигался над проволокой. В результате первого прохода агромоста по агроугодью на нем остаются три уплотненные колеи, причем проволока 37 окажется на дне вспомогательной колеи 38. Перед прокладкой последующих колей проволоку 37 переносят и растягивают на ...

2025945 Способ выращивания насаждений сосны

... Сосна высажена в 1988, 1989 гг. с размещением 1,5х0,7 м. Посадки фундука (орешников) выполнены таким образом, что его ряды находятся в каждом 5 ряду сосны, через 6 м, а в рядах через 8 посадочных мест главной породы. Этот пример конкретного выполнения свидетельствует о технической возможности выполнения заявленного способа, в том числе и механизированным способом при посадке культур, так и при их дополнениях. Сосна и лещина имеют хорошую приживаемость, обеспечивающую формирование древостоя согласно предложенному способу. П р и м е р 4. В 1946 г. в Балаклейском лесхоззаге Б.И.Гавриловым заложен опыт в 8-летнем чистом, абсолютно одновозрастном молодняке на площади 1,9 га, созданных с ...

Еще из этого раздела:

2142696 Способ выращивания цветочных и декоративных растений в тепличных и домашних условиях

2253239 Способ производства средства для обработки растений (варианты)

2250583 Агрегат дернинный комбинированный

2409937 Растение с высоким содержанием ребаудиозида а

2099929 Почвенная растительная смесь для культурных газонов и способ их создания

2261592 Ферма двухконсольного дождевального агрегата

2400960 Ориентирующее устройство для корнеплодов конической формы

2496298 Узел крепления пальцев подборщика

2444769 Жидкостный резервуар, устройство наблюдения для наблюдения под поверхностью жидкости и оптическая пленка

2197817 Поплавок для рыболовных удочек и снастей

Изобретения в сфере сельского хозяйства, животноводства, рыболовства

Способ изготовления костного аллотрансплантата

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ