Способ трансформации растенийПатент на изобретение №: 2128427 Автор: Пащенко В.М. Патентообладатель: Рязанская государственная сельскохозяйственная академия им.проф.П.А.Костычева Дата публикации: 10 Апреля, 1999 Адрес для переписки: 390044, Рязань, ул.Костычева 1, Патентный отдел РГСХА ИзображенияИзобретение относится к области генетики, связанной с расширением спектра исходных форм селекции путем искусственного создания новых мутантных форм растений. Технический результат изобретения заключается в упрощении способа, повышении эффективности трансформации посредством процесса опыления -оплодотворения и получении широкого спектра наследственно измененных форм растений для нужд селекции. К питательной смеси с экзогенной ДНК добавляют акридин оранжевый или бромистый этидий. Смесь выдерживают и наносят на рыльце пестика. Бромистый этидий добавляют до конечной концентрации 10-5 М. Акридин оранжевый добавляют до конечной концентрации 510-5 м. Выдержку осуществляют в течение 1-2 мин. 1 з. п. ф-лы, 1 табл. ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУИзобретение относится к области генетики, связанной с расширением спектра исходных форм селекции путем искусственного создания новых мутантных форм растений, в частности при проведении трансформации посредством процесса опыления-оплодотворения. Известен способ генетической трансформации растений, включающий проведение микроинъекции чужеродной ДНК в протопласты растений [1]. Известен также способ генетической трансформации растений, согласно которому пыльцу растений инкубируют в присутствии ДНК плазмиды, содержащей ген устойчивости к антибиотикам, в частности к канамицину. Методом электропорации вводят плазмидную ДНК в пыльцевые зерна растений, затем растение опыляют и селекцию трансформантов в полученном потомстве проводят по устойчивости к канамицину [2]. Однако известные способы неприемлемы для растений, у которых жизнеспособность пыльцы в значительной степени зависит от времени хранения, например, у злаковых. Наиболее близким к предлагаемому, является способ, заключающийся в том, что обработка рыльца пестика растений производится смесью пыльцы и экзогенной ДНК в растворе сахарозы, использование вектора на основе TI-плазмид, содержащих маркерный ген устойчивости к антибиотикам [3]. При этом в способе, взятом за прототип, плазмиду смешивают с раствором сахарозы, борной кислотой и Ca(NO3)2, причем смесь сразу же наносят на рыльце пестика и немедленно производят опыление, а отбор трансформированных растений производят путем проращивания на среде Кноппа, г/л: Ca(NO3)2 - 0,8; KH2PO4 - 0,2; MgO47H2O - 0,2; KNO3 - 0,2; FePO4 - 0,1, содержащей канамицин в концентрации 250-400 мкг/мл. При опылении в данном способе используются среды следующего состава: 0,4-0,5М сахарозы; 0,017-0,020% борной кислоты; 0,038-0,042% Ca(NO3)2; pH 5,5-5,8; 40-100 мкг/мл плазмидной ДНК (например, PGV1501), содержащей ген устойчивости к канамицину. Используя способ, взятый за прототип, авторам удавалось получать частоту трансформантов на кукурузе около 0,6%, и 1,45% трансформантов на томате "Факел". Недостаток указанного способа, принятого за прототип, заключается в низкой частоте получаемых трансформантов. Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в создании универсального способа трансформации растений, посредством процесса опыления-оплодотворения, имеющего высокую частоту трансформантов. Технический результат, который может быть получен от использования изобретения, заключается в значительном повышении эффективности трансформации посредством процесса опыления-оплодотворения, получения при этом широкого спектра наследственно измененных форм растений для нужд селекции. Указанный технический результат достигается тем, что в способе трансформации растений, включающем смешивание экзогенной ДНК с питательной средой, представляющей собой раствор 0,4-0,5М сахарозы, 0,017-0,020% борной кислоты, 0,038-0,042% Ca(NO3)2, pH 5,5-5,8, нанесение полученной смеси на рыльце пестика растения и немедленное опыление-оплодотворение, перед нанесением полученной смеси на рыльце пестика, к ней добавляют молекулы-интеркаляторы акридина оранжевого, до конечной концентрации 510-5 М, или бромистого этидия, до конечной концентрации 10-5 М. Смесь, содержащую экзогенную ДНК и молекулы-интеркаляторы, выдерживают в течение 1-2 минут и наносят на рыльце пестика растения, после чего немедленного следует опыление. Отбор трансформированных растений производят путем проращивания на среде Кнопа, содержащей антибиотик, например канамицин, в концентрации 100-400 мкг/л. В результате проведенных экспериментов было обнаружено, что с увеличением количества пыльца в питательной среде (ПС) резко возрастает нуклеазная активность, выражающаяся в заметно более скорой деградации плазмидной или линейной форм ДНК, используемых в качестве субстратов. Результаты получены для пыльцы разных сортов томата и кукурузы. Выявлено, что при добавлении к ПС молекул-интеркаляторов, эффект деградации экзогенной ДНК нуклеазами пыльцы резко снижается. Концентрация интеркалятора в ПС должна быть малой, не ингибирующей заметно прорастание пыльцевых зерен. Для каждого вида интеркалятора и сорта растений она легко определяется экспериментально. Например, установлено, что снижение процента прорастания пыльцы кукурузы и томата не превышает 30%, если в ПС содержится интеркалятор акридин оранжевый (АО) в концентрации 510-5 М или этидий бромистый (EtBr) в концентрации 10-5 М. При проведении принудительного опыления растений пыльцой, выдержанной в ПС с указанными концентрациями интеркаляторов, зафиксировано нормальное развитие завязи и далее вегетирующего растения. Исследованиями установлено, что при использовании АО и EtBr, комплексообразование ДНК-интеркалятор происходит в течение 1-2 минут. Однако комплексообразование ДНК с интеркаляторами АО и EtBr осуществляется водородными связями, и в дальнейшем, при попадании комплексов ДНК-интеркалятор в пыльцевые зерна, по мере активизации генетического аппарата, молекулы интеркалятора отторгаются от ДНК и удаляются. Внесение в ПС молекул-интеркаляторов приводит к резкому снижению нуклеазной активности прорастающей пыльцы и сохранение экзогенной ДНК помещенной в ПС с прорастающей пыльцой, от быстрой деградации. Проводилось выдерживание плазмидной и линейной форм ДНК в ПС с прорастающими пыльцевыми зернами. При этом в одном варианте (ПС+EtBr) в ПС добавлялся интеркалятор в малой концентрации, не ингибирующей прорастание. В другом варианте (ПС), ПС была чистой. В результате в ПС с добавленным интеркалятором время деградации всех видов ДНК нуклеазами пыльцы резко возрастает. Деградация плазмиды pBR-322, выдержанной в ПС с прорастающей пыльцой томата "Факел" в отсутствие и в присутствии EtBr в зависимости от времени выдержки t (мин) представлена в таблице. Молекулы-интеркаляторы, имеющие химические сродство к ДНК, встраиваются в молекулу ДНК. Встраивание в ДНК сопровождается изменением пространственной конфигурации сахарофосфатного остова ДНК: при этом меняется степень спирализации нитей ДНК, расстояние между основаниями ДНК и другие параметры. В целом, встраивание интеркалятора в молекулу ДНК приводило к нарушению фермент-субстратных комплексов и ослаблению стерического взаимодействия активных центров нуклеаз пыльцы с фрагментами молекулы ДНК и позволило довести время сохранения суперспирализованной формы плазмиды, в случае АО, до 20 минут, а линейной - до 30 минут. При отсутствии интеркалятора полная 100% деградация всех форм ДНК наблюдалась уже в течение 8-9 минут выдержки. Еще большее время устойчивости к деградированию было достигнуто в том случае, если экзогенная ДНК выдерживалась предварительно в растворе с интеркалятором и добавлялась к прорастающей пыльце уже в чистую ПС. При этом время сохранения суперспирализованной формы плазмиды достигло 35 минут, а линейной - до 50 минут. Методика применения предлагаемого способа трансформации растений, включает в себя этапы: 1. Добавление к питательной среде (ПС), представляющей собой раствор 0,4-0,5М сахарозы, 0,017-0,20% борной кислоты, 0,038-0,042% Ca(NO3)2, pH 5,5-5,8 экзогенной ДНК, например плазмид серии PGV, содержащих маркерный ген устойчивости к антибиотикам (канамицину), до конечной концентрации 40-100 мкг/мл. 2. Добавление к смеси ПС с эзогенной ДНК акридина оранжевого до конечной концентрации 510-5 М или бромистого этидия до концентрации 10-5 М. 3. Выдерживание смеси ПС с экзогенной ДНК и молекулами-интеркаляторами в течение 1-2 минут. 4. Нанесение смеси на рыльце пестика и немедленное опыление-оплодотворение. 5. Отбор трансформированных растений на среде Кнопа, г/л: Ca(NO3)2 - 0,8; KH2PO4 - 0,2; MgO47H2O - 0,2; KNO3 - 0,2; FePO4 -0,1, содержащей канамицин в концентрации 100-400 мкг/мл. Пример. В среду, содержащую 0,45М сахарозы, 0,017% борной кислоты, 0,038% Ca(NO3)2, pH 5,5-5,8, вносят плазмидную ДНК (PGV1501), содержащую ген устойчивости к канамицину до концентрации 80 мкг/мл. К смеси добавляют акридин оранжевый до концентрации 510-5 М и выдерживают смесь в течение 1-2 минут. После чего смесь наносят на рыльце пестика томата и немедленно опыляют. Созревшие семена проращивают на среде Кнопа с канамицином, в концентрации 100 мкг/мл. При использовании сорта томата "Факел", частота трансформации составляет 2,5%. В прототипе на один ген частота трансформации составляет 1,45%, т.е., полученная в результате использования предлагаемого способа частота трансформации в 1,7 раза превосходит полученную в известном способе. Анализ трансформантов методом блотгибридизации по Саузерну показал, что ген устойчивости к канамицину встроился в растительный геном. Таким образом, предложен способ трансформации растений посредством опыления-оплодотворения, в котором осуществляется сохранение в течение определенного времени экзогенного генетического материала, находящегося в контакте с прорастающей пыльцой. Применение заявленного способа в народном хозяйстве не представляет значительных трудностей, не связано с большими затратами на его осуществление и может иметь большое значение для целенаправленной трансформации генома растений. Источники информации 1. Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1985, v. 21, p. 336. 2. Biotechnology and Ecology of Pollen. - 1986, pp. 59-76. 3. Авторское свидетельство СССР N 1708849 A1, C 12 N 15/87, 1992.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ трансформации растений, включающий внесение экзогенной ДНК в питательную смесь, нанесение полученной смеси на рыльце пестика, отличающийся тем, что к питательной смеси с экзогенной ДНК добавляют акридин оранжевый или бромистый этидий и полученную смесь перед нанесением на рыльце пестика выдерживают. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что бромистый этидий добавляют к питательной смеси с экзогенной ДНК до конечной концентрации 10-5 М, а акридин оранжевый - до конечной концентрации 5 10-5 М, при этом выдержку осуществляют в течение 1 - 2 мин.Популярные патенты: 2217912 Способ проведения контрольного лова молоди пелагических рыб, в частности лососевых, и обкидной невод ... в посадке, м - 8,0 Высота просвета мотни в жгуте, м - 6,2 Длина мотни невода в посадке, м - 18,0 Масса сетной части невода, кг - 318,0 Масса невода в намокшем состоянии, кг - 2760,0 Минимальный размер ячеи (шаг ячеи) в зависимости от исполнения, мм - 13(5,5)/8(4) Изготовление направляющей части невода из крыльев и урезов с одинаковой суммарной длиной, при этом первую от привода часть крыла изготавливают из дели капроновой 93,5 тексх4 с шагом ячеи 12 мм, далее крыло - из дели капроновой 93,5 тексх12 с шагом ячеи 20 мм, далее из дели капроновой 93,5 тексх4 с шагом ячеи 30 мм и концы крыла из дели капроновой 93,5 тексх3,1 с шагом ячеи 100 мм, а также изготовление крыльев из ... 2421965 Способ возделывания зерновых колосовых культур ... достигается тем, что в известном способе, включающем однократную обработку семян действующим веществом, их посев и однократную обработку этим же веществом растений в фазе весеннего кущения, согласно предлагаемому способу в качестве действующего вещества используют метионин, семена обрабатывают из расчета 4-10 г действующего вещества на 1 тонну семян, а при обработке растений в фазу весеннего кущения - из расчета 4-10 г действующего вещества на 1 гектар посевов.Новизна предлагаемого способа состоит в применении в качестве действующего вещества метионина, так как он нейтрализует воздействие фитопатогенных бактерий рода Pseudomonas syringae на семенной материал и на растения в фазу ... 2476068 Фильтр для использования при переработке пищевых продуктов ... продукта и со стоком (20) для отфильтрованного продукта, выходное отверстие для отфильтрованного остатка и расположенную между приемным отверстием (16) и стоком (20) фильтровальную вставку (14) с цилиндрической фильтрующей стенкой, через которую в радиальном направлении изнутри наружу проходит продукт, отличающийся тем, чтов фильтровальной вставке (14) установлен соосно с возможностью вращения основной элемент (30), при этом форма основного элемента (30) приведена в соответствие с кольцевым пространством (36), которое образуется между основным элементом (30) и стенкой фильтра, окружающей основной элемент, и основной элемент (30) имеет такие размеры, что образующееся кольцевое ... 2438305 Способ выращивания цыплят-бройлеров ... на птице кросса «СК Русь 6». В опыте птицу выращивали по предлагаемому способу, а контролем служил прототип. Плотность посадки в опыте при выращивании бройлеров на подстилке в птичнике с суточного до 2-4-недельного возраста составляла 28 гол./м2 с фронтом кормления 4,0-4,2 см/гол., с фронтом поения 1,3-1,4 см/гол., с последующим выращиванием бройлеров на выгулах до 6-недельного возраста с плотностью посадки птицы 1 гол./м2, с фронтом кормления 5,2-5,7 см/гол. и фронтом поения - 1,8-2,0 см/гол., при температуре воздуха не ниже 18°C. Плотность посадки в контроле (прототип) при содержании птицы на полу раздельно по полу с начала выращивания до 10-недельного возраста ... 2271095 Многофункциональное устройство ... и устройства для поворота и фиксации 3. Измельчающее устройство 2 может оперативно переналаживаться в другие устройства (смеситель, наждачный круг, вентилятор, маслобойку и многие другие). А на несменяемую часть (разрез А-А) можно устанавливать многие другие устройства. Измельчающее устройство 2 может быть любого типа и включает, например, рабочий орган 4 с приводом 5, камеру измельчения 6, зону загрузки 7, например, в виде бункера 7а или вставки 7в и зону выгрузки 8 материала. Привод 5 может представлять собой, например, электродвигатель, двигатель, мотор-редуктор с трансмиссией 9. Рабочий орган 4 включает ротор 10 с измельчающими элементами 11. Устройство поворота и фиксации 3 ... |
Еще из этого раздела: 2094986 Гербицидный состав 2452155 Лапа культиватора 2462016 Устройство для протравливания семян 2423807 Культиватор (варианты) и фреза для него 2432394 Ингибирование образования биогенного сульфида посредством комбинации биоцида и метаболического ингибитора 2488263 Система механической подачи недомолота для вторичного обмолота на возвратную доску 2400042 Высевающий аппарат 2090040 Машина для возделывания корнеклубневых культур 2127511 Композиция пленочного полимерного материала для покрытия теплиц и оптический активатор для полимерного материала (варианты) 2204241 Способ определения поливных норм при капельном орошении томатов |