Способ трансформации растенийПатент на изобретение №: 2128427 Автор: Пащенко В.М. Патентообладатель: Рязанская государственная сельскохозяйственная академия им.проф.П.А.Костычева Дата публикации: 10 Апреля, 1999 Адрес для переписки: 390044, Рязань, ул.Костычева 1, Патентный отдел РГСХА Изображения Изобретение относится к области генетики, связанной с расширением спектра исходных форм селекции путем искусственного создания новых мутантных форм растений. Технический результат изобретения заключается в упрощении способа, повышении эффективности трансформации посредством процесса опыления -оплодотворения и получении широкого спектра наследственно измененных форм растений для нужд селекции. К питательной смеси с экзогенной ДНК добавляют акридин оранжевый или бромистый этидий. Смесь выдерживают и наносят на рыльце пестика. Бромистый этидий добавляют до конечной концентрации 10-5 М. Акридин оранжевый добавляют до конечной концентрации 5  10-5 м. Выдержку осуществляют в течение 1-2 мин. 1 з. п. ф-лы, 1 табл.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУИзобретение относится к области генетики, связанной с расширением спектра исходных форм селекции путем искусственного создания новых мутантных форм растений, в частности при проведении трансформации посредством процесса опыления-оплодотворения. Известен способ генетической трансформации растений, включающий проведение микроинъекции чужеродной ДНК в протопласты растений [1]. Известен также способ генетической трансформации растений, согласно которому пыльцу растений инкубируют в присутствии ДНК плазмиды, содержащей ген устойчивости к антибиотикам, в частности к канамицину. Методом электропорации вводят плазмидную ДНК в пыльцевые зерна растений, затем растение опыляют и селекцию трансформантов в полученном потомстве проводят по устойчивости к канамицину [2]. Однако известные способы неприемлемы для растений, у которых жизнеспособность пыльцы в значительной степени зависит от времени хранения, например, у злаковых. Наиболее близким к предлагаемому, является способ, заключающийся в том, что обработка рыльца пестика растений производится смесью пыльцы и экзогенной ДНК в растворе сахарозы, использование вектора на основе TI-плазмид, содержащих маркерный ген устойчивости к антибиотикам [3]. При этом в способе, взятом за прототип, плазмиду смешивают с раствором сахарозы, борной кислотой и Ca(NO3)2, причем смесь сразу же наносят на рыльце пестика и немедленно производят опыление, а отбор трансформированных растений производят путем проращивания на среде Кноппа, г/л: Ca(NO3)2 - 0,8; KH2PO4 - 0,2; MgO47H2O - 0,2; KNO3 - 0,2; FePO4 - 0,1, содержащей канамицин в концентрации 250-400 мкг/мл. При опылении в данном способе используются среды следующего состава: 0,4-0,5М сахарозы; 0,017-0,020% борной кислоты; 0,038-0,042% Ca(NO3)2; pH 5,5-5,8; 40-100 мкг/мл плазмидной ДНК (например, PGV1501), содержащей ген устойчивости к канамицину. Используя способ, взятый за прототип, авторам удавалось получать частоту трансформантов на кукурузе около 0,6%, и 1,45% трансформантов на томате "Факел". Недостаток указанного способа, принятого за прототип, заключается в низкой частоте получаемых трансформантов. Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в создании универсального способа трансформации растений, посредством процесса опыления-оплодотворения, имеющего высокую частоту трансформантов. Технический результат, который может быть получен от использования изобретения, заключается в значительном повышении эффективности трансформации посредством процесса опыления-оплодотворения, получения при этом широкого спектра наследственно измененных форм растений для нужд селекции. Указанный технический результат достигается тем, что в способе трансформации растений, включающем смешивание экзогенной ДНК с питательной средой, представляющей собой раствор 0,4-0,5М сахарозы, 0,017-0,020% борной кислоты, 0,038-0,042% Ca(NO3)2, pH 5,5-5,8, нанесение полученной смеси на рыльце пестика растения и немедленное опыление-оплодотворение, перед нанесением полученной смеси на рыльце пестика, к ней добавляют молекулы-интеркаляторы акридина оранжевого, до конечной концентрации 510-5 М, или бромистого этидия, до конечной концентрации 10-5 М. Смесь, содержащую экзогенную ДНК и молекулы-интеркаляторы, выдерживают в течение 1-2 минут и наносят на рыльце пестика растения, после чего немедленного следует опыление. Отбор трансформированных растений производят путем проращивания на среде Кнопа, содержащей антибиотик, например канамицин, в концентрации 100-400 мкг/л. В результате проведенных экспериментов было обнаружено, что с увеличением количества пыльца в питательной среде (ПС) резко возрастает нуклеазная активность, выражающаяся в заметно более скорой деградации плазмидной или линейной форм ДНК, используемых в качестве субстратов. Результаты получены для пыльцы разных сортов томата и кукурузы. Выявлено, что при добавлении к ПС молекул-интеркаляторов, эффект деградации экзогенной ДНК нуклеазами пыльцы резко снижается. Концентрация интеркалятора в ПС должна быть малой, не ингибирующей заметно прорастание пыльцевых зерен. Для каждого вида интеркалятора и сорта растений она легко определяется экспериментально. Например, установлено, что снижение процента прорастания пыльцы кукурузы и томата не превышает 30%, если в ПС содержится интеркалятор акридин оранжевый (АО) в концентрации 510-5 М или этидий бромистый (EtBr) в концентрации 10-5 М. При проведении принудительного опыления растений пыльцой, выдержанной в ПС с указанными концентрациями интеркаляторов, зафиксировано нормальное развитие завязи и далее вегетирующего растения. Исследованиями установлено, что при использовании АО и EtBr, комплексообразование ДНК-интеркалятор происходит в течение 1-2 минут. Однако комплексообразование ДНК с интеркаляторами АО и EtBr осуществляется водородными связями, и в дальнейшем, при попадании комплексов ДНК-интеркалятор в пыльцевые зерна, по мере активизации генетического аппарата, молекулы интеркалятора отторгаются от ДНК и удаляются. Внесение в ПС молекул-интеркаляторов приводит к резкому снижению нуклеазной активности прорастающей пыльцы и сохранение экзогенной ДНК помещенной в ПС с прорастающей пыльцой, от быстрой деградации. Проводилось выдерживание плазмидной и линейной форм ДНК в ПС с прорастающими пыльцевыми зернами. При этом в одном варианте (ПС+EtBr) в ПС добавлялся интеркалятор в малой концентрации, не ингибирующей прорастание. В другом варианте (ПС), ПС была чистой. В результате в ПС с добавленным интеркалятором время деградации всех видов ДНК нуклеазами пыльцы резко возрастает. Деградация плазмиды pBR-322, выдержанной в ПС с прорастающей пыльцой томата "Факел" в отсутствие и в присутствии EtBr в зависимости от времени выдержки t (мин) представлена в таблице. Молекулы-интеркаляторы, имеющие химические сродство к ДНК, встраиваются в молекулу ДНК. Встраивание в ДНК сопровождается изменением пространственной конфигурации сахарофосфатного остова ДНК: при этом меняется степень спирализации нитей ДНК, расстояние между основаниями ДНК и другие параметры. В целом, встраивание интеркалятора в молекулу ДНК приводило к нарушению фермент-субстратных комплексов и ослаблению стерического взаимодействия активных центров нуклеаз пыльцы с фрагментами молекулы ДНК и позволило довести время сохранения суперспирализованной формы плазмиды, в случае АО, до 20 минут, а линейной - до 30 минут. При отсутствии интеркалятора полная 100% деградация всех форм ДНК наблюдалась уже в течение 8-9 минут выдержки. Еще большее время устойчивости к деградированию было достигнуто в том случае, если экзогенная ДНК выдерживалась предварительно в растворе с интеркалятором и добавлялась к прорастающей пыльце уже в чистую ПС. При этом время сохранения суперспирализованной формы плазмиды достигло 35 минут, а линейной - до 50 минут. Методика применения предлагаемого способа трансформации растений, включает в себя этапы: 1. Добавление к питательной среде (ПС), представляющей собой раствор 0,4-0,5М сахарозы, 0,017-0,20% борной кислоты, 0,038-0,042% Ca(NO3)2, pH 5,5-5,8 экзогенной ДНК, например плазмид серии PGV, содержащих маркерный ген устойчивости к антибиотикам (канамицину), до конечной концентрации 40-100 мкг/мл. 2. Добавление к смеси ПС с эзогенной ДНК акридина оранжевого до конечной концентрации 510-5 М или бромистого этидия до концентрации 10-5 М. 3. Выдерживание смеси ПС с экзогенной ДНК и молекулами-интеркаляторами в течение 1-2 минут. 4. Нанесение смеси на рыльце пестика и немедленное опыление-оплодотворение. 5. Отбор трансформированных растений на среде Кнопа, г/л: Ca(NO3)2 - 0,8; KH2PO4 - 0,2; MgO47H2O - 0,2; KNO3 - 0,2; FePO4 -0,1, содержащей канамицин в концентрации 100-400 мкг/мл. Пример. В среду, содержащую 0,45М сахарозы, 0,017% борной кислоты, 0,038% Ca(NO3)2, pH 5,5-5,8, вносят плазмидную ДНК (PGV1501), содержащую ген устойчивости к канамицину до концентрации 80 мкг/мл. К смеси добавляют акридин оранжевый до концентрации 510-5 М и выдерживают смесь в течение 1-2 минут. После чего смесь наносят на рыльце пестика томата и немедленно опыляют. Созревшие семена проращивают на среде Кнопа с канамицином, в концентрации 100 мкг/мл. При использовании сорта томата "Факел", частота трансформации составляет 2,5%. В прототипе на один ген частота трансформации составляет 1,45%, т.е., полученная в результате использования предлагаемого способа частота трансформации в 1,7 раза превосходит полученную в известном способе. Анализ трансформантов методом блотгибридизации по Саузерну показал, что ген устойчивости к канамицину встроился в растительный геном. Таким образом, предложен способ трансформации растений посредством опыления-оплодотворения, в котором осуществляется сохранение в течение определенного времени экзогенного генетического материала, находящегося в контакте с прорастающей пыльцой. Применение заявленного способа в народном хозяйстве не представляет значительных трудностей, не связано с большими затратами на его осуществление и может иметь большое значение для целенаправленной трансформации генома растений. Источники информации 1. Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1985, v. 21, p. 336. 2. Biotechnology and Ecology of Pollen. - 1986, pp. 59-76. 3. Авторское свидетельство СССР N 1708849 A1, C 12 N 15/87, 1992.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ трансформации растений, включающий внесение экзогенной ДНК в питательную смесь, нанесение полученной смеси на рыльце пестика, отличающийся тем, что к питательной смеси с экзогенной ДНК добавляют акридин оранжевый или бромистый этидий и полученную смесь перед нанесением на рыльце пестика выдерживают. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что бромистый этидий добавляют к питательной смеси с экзогенной ДНК до конечной концентрации 10-5 М, а акридин оранжевый - до конечной концентрации 5 10-5 М, при этом выдержку осуществляют в течение 1 - 2 мин.Популярные патенты: 2217912 Способ проведения контрольного лова молоди пелагических рыб, в частности лососевых, и обкидной невод ... в посадке, м - 8,0 Высота просвета мотни в жгуте, м - 6,2 Длина мотни невода в посадке, м - 18,0 Масса сетной части невода, кг - 318,0 Масса невода в намокшем состоянии, кг - 2760,0 Минимальный размер ячеи (шаг ячеи) в зависимости от исполнения, мм - 13(5,5)/8(4) Изготовление направляющей части невода из крыльев и урезов с одинаковой суммарной длиной, при этом первую от привода часть крыла изготавливают из дели капроновой 93,5 тексх4 с шагом ячеи 12 мм, далее крыло - из дели капроновой 93,5 тексх12 с шагом ячеи 20 мм, далее из дели капроновой 93,5 тексх4 с шагом ячеи 30 мм и концы крыла из дели капроновой 93,5 тексх3,1 с шагом ячеи 100 мм, а также изготовление крыльев из ... 2421965 Способ возделывания зерновых колосовых культур ... достигается тем, что в известном способе, включающем однократную обработку семян действующим веществом, их посев и однократную обработку этим же веществом растений в фазе весеннего кущения, согласно предлагаемому способу в качестве действующего вещества используют метионин, семена обрабатывают из расчета 4-10 г действующего вещества на 1 тонну семян, а при обработке растений в фазу весеннего кущения - из расчета 4-10 г действующего вещества на 1 гектар посевов.Новизна предлагаемого способа состоит в применении в качестве действующего вещества метионина, так как он нейтрализует воздействие фитопатогенных бактерий рода Pseudomonas syringae на семенной материал и на растения в фазу ... 2476068 Фильтр для использования при переработке пищевых продуктов ... продукта и со стоком (20) для отфильтрованного продукта, выходное отверстие для отфильтрованного остатка и расположенную между приемным отверстием (16) и стоком (20) фильтровальную вставку (14) с цилиндрической фильтрующей стенкой, через которую в радиальном направлении изнутри наружу проходит продукт, отличающийся тем, чтов фильтровальной вставке (14) установлен соосно с возможностью вращения основной элемент (30), при этом форма основного элемента (30) приведена в соответствие с кольцевым пространством (36), которое образуется между основным элементом (30) и стенкой фильтра, окружающей основной элемент, и основной элемент (30) имеет такие размеры, что образующееся кольцевое ... 2438305 Способ выращивания цыплят-бройлеров ... на птице кросса «СК Русь 6». В опыте птицу выращивали по предлагаемому способу, а контролем служил прототип. Плотность посадки в опыте при выращивании бройлеров на подстилке в птичнике с суточного до 2-4-недельного возраста составляла 28 гол./м2 с фронтом кормления 4,0-4,2 см/гол., с фронтом поения 1,3-1,4 см/гол., с последующим выращиванием бройлеров на выгулах до 6-недельного возраста с плотностью посадки птицы 1 гол./м2, с фронтом кормления 5,2-5,7 см/гол. и фронтом поения - 1,8-2,0 см/гол., при температуре воздуха не ниже 18°C. Плотность посадки в контроле (прототип) при содержании птицы на полу раздельно по полу с начала выращивания до 10-недельного возраста ... 2271095 Многофункциональное устройство ... и устройства для поворота и фиксации 3. Измельчающее устройство 2 может оперативно переналаживаться в другие устройства (смеситель, наждачный круг, вентилятор, маслобойку и многие другие). А на несменяемую часть (разрез А-А) можно устанавливать многие другие устройства. Измельчающее устройство 2 может быть любого типа и включает, например, рабочий орган 4 с приводом 5, камеру измельчения 6, зону загрузки 7, например, в виде бункера 7а или вставки 7в и зону выгрузки 8 материала. Привод 5 может представлять собой, например, электродвигатель, двигатель, мотор-редуктор с трансмиссией 9. Рабочий орган 4 включает ротор 10 с измельчающими элементами 11. Устройство поворота и фиксации 3 ... |
Еще из этого раздела: 2094986 Гербицидный состав 2452155 Лапа культиватора 2462016 Устройство для протравливания семян 2423807 Культиватор (варианты) и фреза для него 2432394 Ингибирование образования биогенного сульфида посредством комбинации биоцида и метаболического ингибитора 2488263 Система механической подачи недомолота для вторичного обмолота на возвратную доску 2400042 Высевающий аппарат 2090040 Машина для возделывания корнеклубневых культур 2127511 Композиция пленочного полимерного материала для покрытия теплиц и оптический активатор для полимерного материала (варианты) 2204241 Способ определения поливных норм при капельном орошении томатов |
Изобретения в сельском хозяйстве
Обработка почвы в сельском и лесном хозяйствах
Посадка, посев, удобрение
Уборка урожая, жатва
Обработка и хранение продуктов полеводства и садоводства
Садоводство, разведение овощей, цветов, риса, фруктов, винограда, лесное хозяйство
Новые виды растений или способы их выращивания
Производство молочных продуктов
Животноводство, разведение и содержание птицы, рыбы, насекомых, рыбоводство, рыболовство
Поимка, отлов или отпугивание животных
Консервирование туш животных, или растений или их частей
Биоцидная, репеллентная, аттрактантная или регулирующая рост растений активность химических соединений или препаратов
Хлебопекарные печи, машины и прочее оборудование для хлебопечения
Машины или оборудование для приготовления или обработки теста
Обработка муки или теста для выпечки, способы выпечки, мучные изделия
|
|
||