Способ трансформации растений

Международная патентная классификация:       A01H

Патент на изобретение №:      2123781

Автор:      Пащенко В.М., Новикова Н.Н.

Патентообладатель:      Рязанская государственная сельскохозяйственная академия им.проф.П.А.Костычева

Дата публикации:      27 Декабря, 1998

Изображения

Способ предназначен для селекции растений. Ингибирование нуклеазной активности прорастающих пыльцевых зерен достигается воздействием на пыльцевые зерна сверхвысокочастотного электромагнитного поля, частота и интенсивность которого выбираются для каждого вида пыльцы по предлагаемой методике. 3 з.п.ф-лы., 1 табл.

Изобретение относится к области генетики, связанной с расширением спектра исходных форм селекции путем искусственного создания новых мутантных форм растений, в частности, при проведении трансформации посредством процесса опыления-оплодотворения.

Одна из основных проблем, с которыми сталкиваются при проведении трансформации посредством процесса опыления-оплодотворения, это нуклеазная активность прорастающей пыльцы. Проблема до настоящего времени не решена, хотя было предложено несколько вариантов ее устранения: 1. отмывка пыльцевых зерен от нуклеаз; 2. добавление к донорной ДНК иной высокомолекулярной ДНК в качестве ингибирующего субстрата для нуклеаз; 3. использование в качестве нуклеазных ингибиторов неорганических солей; 4. применение липосом для доставки экзогенной ДНК в пыльцевые зерна.

Попытки устранения нуклеазной активности прорастающей пыльцы способами 1 - 3 не привело к сколько-нибудь значимым практическим результатам. Возможно, это было связано с тем, что воздействию подвергалось само пыльцевое зерно или нуклеазы зерна (отмывка от нуклеаз, воздействие неорганических солей и т. д. ). При этом наиболее вероятным представляется общее нарушение развития пыльцевого зерна при нарушениях отдельных этапов или механизмов этого процесса. В этом смысле способ 4 предпочтительней, т.к., применение липосом для доставки экзогенной ДНК в пыльцевые зерна основано на естественных биологических механизмах прорастающего пыльцевого зерна и не требует подавления его нормальной жизнедеятельности. Возможно, именно поэтому трансформация по способу 4 дала наибольший процент удачных работ.

Наиболее близким к заявленному способу трансформации посредством процесса опыления-оплодотворения является способ трансформации посредством опыления-оплодотворения с применением липосом для доставки экзогенной ДНК в пыльцевые зерна [1]. В этом способе сохранение экзогенного генетического материала от гидролитического расщепления нуклеазами пыльцевых зерен достигается посредством упаковки экзогенной ДНК в предварительно выделенные липосомы с последующей доставкой липосом в прорастающие пыльцевые зерна. При этом упакованный в липосомы генетический материал в процессе доставки в прорастающее пыльцевое зерно является недоступным для расщепления нуклеазами пыльцевых зерен.

Недостаток указанного способа, принятого за прототип, заключается в высоком уровне технологической сложности при подготовке и проведении процессов опыления-оплодотворения, что делает его весьма затруднительным при массовом использовании.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в создании универсального способа трансформации посредством опыления-оплодотворения пыльцой с экзогенным генетическим материалом, доступного для массового применения в селекционной практике.

Технический результат, который может быть получен от использования изобретения, заключается в значительном повышении эффективности трансформации посредством процесса опыления-оплодотворения, получения при этом широкого спектра наследственно измененных форм растений для нужд селекции.

Указанный технический результат достигается тем, что производят воздействие электромагнитного поля сверхвысокочастотного (СВЧ) диапазона на пыльцевые зерна, к которым добавляется экзогенный генетический материал. При этом частоту электромагнитного поля выбирают из интервала от 1000 МГц до 3000 МГц, интенсивность поля выбирают для непрерывного режима воздействия из интервала от 102 Вт/м2 до 104 Вт/м2 и для импульсного режима воздействия из интервала от 103 Вт/м2 до 106 Вт/м2. При импульсном воздействии СВЧ-поля длительность импульсов выбирают из интервала от 10-2 с до 10-4 с, а длительность пауз во всех случаях выбирают в 100 раз большей, чем длительность импульсов.

Известно, что молекула ДНК в естественных условиях окружена гидратной оболочкой из упорядоченно расположенных молекул воды [2]. Наличие водной оболочки обусловлено возникновением водородных связей между дипольными молекулами воды и разнополярными группировками молекул ДНК. Водное окружение ДНК представляет собой несколько слоев, причем молекулы ближайшего к ДНК водного слоя обладают наибольшей силой сцепления с ДНК. По мере удаления водного слоя от ДНК сила сцепления его молекул с ДНК ослабевает из-за экранирования электростатического взаимодействия молекулами воды, более близко расположенными к ДНК, и вследствие теплового молекулярного движения, "размывающего" эффект упорядоченного расположения дальних от ДНК молекул воды. Действие нуклеаз на ДНК происходит только в водном окружении при постепенном вытеснении молекул воды от ДНК молекулами нуклеаз в тех местах, в которых нуклеазы обладают наибольшим химическим сродством к участкам ДНК. Между тем электромагнитное поле в области СВЧ-частот является резонансным для дипольных молекул воды с пиком резонанса в области 1500 - 2000 МГц. Энергия электромагнитного поля с указанной частотой максимально поглощается избирательно молекулами воды, вследствие чего они приобретают колебательное вращательное движение. Меняя интенсивность СВЧ-поля, можно подобрать такую плотность энергии СВЧ-поля, которой будет достаточно для приведения во вращательное колебательное движение молекул воды в слоях, непосредственно не примыкающих к ДНК, но недостаточно для приведения во вращательное движение молекул воды, непосредственно примыкающих к молекуле ДНК. При этом не будет нарушаться пространственная конформация молекулы экзогенной ДНК и вместе с тем вокруг нее будет создан слой вращающихся осцилляторов из молекул воды, препятствующий нормальному воздействию нуклеаз на ДНК.

Правильный выбор интенсивности СВЧ-поля в заявляемом способе имеет особое значение. Недостаточная интенсивность поля не позволит создать защитного слоя осцилляторов вокруг ДНК, избыточная интенсивность приведет к осциллированию слоя молекул воды, непосредственно примыкающих к ДНК, что неизбежно вызовет нарушение ее пространственной конформации. Расчеты показывают, что должно использоваться электромагнитное излучение (ЭМИ) с частотами от 1000 МГц до 3000 МГц с интервалами интенсивностей в непрерывном режиме облучения от 102 Вт/м2 до 104 Вт/м2 и в импульсном от 103 Вт/м2 до 106 Вт/м2. При этом в импульсном режиме длительность импульсов должна будет составлять от 10-2 с до 10-4 с, длительность пауз между импульсами во всех случаях будет в 100 раз превышать длительность самих импульсов. Конкретный выбор параметров СВЧ-поля должен определяться конкретным объектом трансформации, так как пыльцевые зерна разных видов имеют на мембране различные наборы и концентрации нуклеаз, различное водосодержание и различные безопасные пороги интенсивностей СВЧ-поля, не приводящих к нарушению нормальных процессов жизнедеятельности.

В таблице приведены результаты деградации плазмиды pBR-322, выдержанной в питательной смеси с прорастающей пыльцой томата "Факел" в отсутствие импульсного СВЧ-поля и при облучении.

Для используемой пыльцы предварительно были подобраны параметры СВЧ-поля, не ингибирующие ее нормальное прорастание. Облучение СВЧ-полем производилось импульсно, длительность импульса составляла 10-3 с, длительность паузы - 10-1 с, интенсивность СВЧ-поля I была равна 103 Вт/м2, частота СВЧ-поля v была равна 2500 МГц.

Из таблицы видно, что при контакте с пыльцой в обычных условиях уже через 10 минут выдерживания наблюдалась 100% деградация плазмиды. При наличии же СВЧ-поля даже через 60 минут выдерживания степень деградации суперспирализованной формы плазмиды не превысила 25%.

Таким образом, предложен способ трансформации растений посредством опыления-оплодотворения, в котором сохранение в течение определенного времени экзогенного генетического материала, находящегося в контакте с прорастающей пыльцой, обеспечивается воздействием СВЧ-поля, снижающего возможность взаимодействия нуклеаз пыльцы и экзогенной ДНК на поверхности пыльцевых зерен.

Методика реализации предложенного способа трансформации растений посредством опыления-оплодотворения с сохранением экзогенного генетического материала на поверхности пыльцевого зерна посредством использования СВЧ-излучения состоит из трех обязательных этапов, при этом конкретные количественные значения величин на каждом этапе подбираются индивидуально для каждого вида пыльцы.

1. Определение нижней границы интенсивности СВЧ-поля в частотном диапазоне от 1000 МГц до 3000 МГц, не ингибирующего нормальное прорастание пыльцы, и последующее опыление-оплодотворение с ее участием.

2. Помещение планируемого экзогенного генетического материала в среду с прорастающими пыльцевыми зернами и одновременное воздействие СВЧ-поля с интенсивностью, определенной из п. 1, и с набором частот из диапазона от 1000 МГц до 3000 МГц. После каждого облучения должен быть проведен анализ целостности экзогенной ДНК, например, методом гель-электрофореза. Из серии опытов выбирается частота СВЧ-поля, при которой обеспечивается максимальное сохранение экзогенного генетического материала.

3. На основании полученных значений интенсивности и частоты СВЧ-поля можно проводить массовое опыление растений в полевых условиях. Предварительно собранная с растений и подготовленная пыльца в зависимости от вида растения может а) помещаться в питательную смесь с одновременным добавлением в нее экзогенного генетического материала и воздействием СВЧ-поля в течение времени, достаточного для транспорта экзогенного генетического материала с поверхности внутрь пыльцевого зерна, но не превышающего время прорастания данных пыльцевых зерен, после чего пыльцевые зерна наносятся непосредственно на рыльце пестика, б) помещаться на рыльце пестика с одновременным добавлением экзогенного генетического материала и воздействием на рыльце пестика СВЧ-поля. Этот путь представляется более предпочтительным для растений с малым временем прорастания пыльцевых зерен, например для кукурузы.

Применение заявленного способа в народном хозяйстве не представляет значительных трудностей, не связано с большими затратами на его осуществление и может иметь большое значение для экспериментального мутагенеза и селекции с целью создания новых искусственных мутантных и рекомбинантных форм растений с нужными народнохозяйственными признаками.

Источники информации 1. Ahokas H. Transfection by DNA-associated liposomes evidenced of pea pollination. // J. Hereditas. 1987, v. 106, p. 129 - 138 - прототип.

2. Давыдов А. С. Биология и квантовая механика, Киев, "Наукова думка", 1979, с. 45 - 53.

Формула изобретения

1. Способ трансформации растений посредством опыления-оплодотворения пыльцой с экзогенным генетическим материалом, отличающийся тем, что экзогенный генетический материал добавляют к пыльце с одновременным воздействием на пыльцу электромагнитным полем сверхвысокочастотного диапазона.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что электромагнитное поле используют с частотой 1000 - 3000 МГц.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что интенсивность электромагнитного поля выбирают для непрерывного режима воздействия из интервала 102 - 104 Вт/м2 и для импульсного режима воздействия из интервала 103 - 106 Вт/м2.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что длительность импульсов при импульсном режиме воздействия электромагнитного поля выбирают из интервала 10-2 - 10-4 с, а длительность пауз во всех случаях в 100 раз превышает длительность самих импульсов.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 03.12.1999

Номер и год публикации бюллетеня: 8-2002

Извещение опубликовано: 27.03.2002

Популярные патенты:

2182889 Дезинфицирующее средство

... Сравнительные испытания и оценка влияния средства на технологические, органолептические и физико-химические характеристики питьевой воды продемонстрировали возможность его эффективного и широкого использования в процессах водоподготовки. Таким образом, в силу своих дезинфицирующих и гигиенических свойств предлагаемое средство может быть применено для очистки и обеззараживания питьевой воды, городских и промышленных сточных вод, воды плавательных бассейнов и систем охлаждения оборудования, горячей воды открытых систем теплоснабжения, а также защиты трубопроводов и сооружений от патогенных бактерий и биологического обрастания. При этом достигается необходимый технологический эффект ...

2490869 Способ направленного изменения циркуляции воздушных масс и связанных с ней погодных условий

... закручивая ионизированный воздух в атмосферный вихрь.4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что ограничивают восходящий поток воздуха путем поднятия на высоту, по крайней мере, одного ионизатора, входящего в блок, и создания встречного потока противоположно заряженных ионов.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что блоки ионизаторов располагают по окружности и включают их поочередно на заданное время Т работы каждого блока ионизаторов.6. Способ по п.5, отличающийся тем, что после включения одного из блоков ионизаторов каждый последующий блок включают через 2/3 Т.7. Способ по п.6, отличающийся тем, что блоки ионизаторов включают по направлению вращения или против ...

2253227 Устройство для регулирования температуры в улье

... источника питания, первая и вторая клеммы для подключения источника питания соединены с шинами питания датчика внутриульевой температуры, первой схемой сравнения, микрофонного усилителя, первого и второго полосовых фильтров, второй схемы сравнения, первый выход датчика внешней температуры соединен с первым выходом задатчика внешней температуры и входом третьей схемы сравнения, выход которой соединен с первым входом триггера и вторым входом блока начальной установки, первый выход управляемого задатчика температуры соединен с входом первой схемы сравнения, первый выход которой соединен с первым входом второго элемента И, второй выход первой схемы сравнения соединен с первым входом ...

2189718 Пневматический высевающий аппарат

... виде выступа в зоне отражения лишних семян и содержащего дополнительные вырезы круглого сечения и отгибы, расположенные над этими вырезами, и ворошилку. Недостатком этого аппарата является то, что он не может одновременно высевать семена двух различных культур. Известен пневматический высевающий аппарат [2], позволяющий производить одновременный высев семян двух культур, содержащий корпус, разделенную на два отсека семенную камеру и вакуумную камеру, установленный между ними на горизонтальном валу высевающий диск с двумя рядами шахматно расположенных отверстий, каждый из которых расположен на определенном расстоянии от оси вращения диска. Недостатком этого аппарата является низкая ...

2455815 Самоходный универсальный комбайн для уборки картофеля и топинамбура

... под ботвозажимающими полотнами 35, перпендикулярно их движению, стебли освобождаются от клубней, которые оставались висеть на длинных нитях. Так ботва полностью освобождается от клубней, даже если они висели на длинных нитях. Освобожденная от клубней ботва ботвоприжимными полотнами 35 подается на горизонтальную часть транспортной ленты ботвовыносного транспортера 28 (которая на фиг.2, 4 условно не показана). Потом ботва ботвовыносным транспортером 28 выносится за пределы переднего ботвоудаляющего механизма на транспортное средство в бункер для ботвы (на схеме не показано) или на почву в валки.Клубни взрыхленных клубненосных рядков, оставшихся в почве или на почве после ...

Еще из этого раздела:

2294617 Устройство для отрезания и погрузки силоса и сенажа

2473366 Вещество, обладающее антимикробным действием

2093022 Устройство для выпаивания животных

2420940 Энергосберегающий способ обеззараживания семян люпина от антракноза

2197817 Поплавок для рыболовных удочек и снастей

2394414 Соединительное устройство для сельскохозяйственной машины

2406295 Способ экологического мониторинга лесов

2175833 Охладитель молока с аккумулятором холода

2455825 Пестицидная аэрозольная композиция

2238970 Штамм mycelia sterilia лх-1-продуцент комплекса биологически активных веществ, обладающих рострегуляторными свойствами

Изобретения в сфере сельского хозяйства, животноводства, рыболовства

Способ трансформации растений

Изображения

Формула изобретения