Инсектицидный препарат "колорадо" против жесткокрылых насекомых и штамм бактерий bacillus thuringiensis, используемый для получения инсектицидного препаратаПатент на изобретение №: 2081583 Автор: Азизбекян Р.Р., Миненкова И.Б., Смирнова Т.А., Шагов Е.М., Константинова Г.Е., Дебабов В.Г., Параскевов В.Г., Калужский В.Е., Турков М.И., Дронова Н.В., Бизунок С.Н., Егорова Т.С., Свентицкий Е.Н. Патентообладатель: Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Дата публикации: 20 Июня, 1997 Адрес для переписки: подача заявки07.04.1993 публикация патента20.06.1997 Изображения Использование: промышленная микробиология, в частности способы получения энтомопатогенных препаратов для борьбы с жесткокрылыми насекомыми. Сущность: изобретение заключается в создании штамма-продуцента Bacillus thuringiensis (ВКПМ B-6306), который синтезирует кристаллический белковый эндотоксин, обладающий высокой специфической активностью против жесткокрылых насекомых. А также - в создании биоинсектицида "Колорадо" на основе штамма Bacillus thuringiensis ВКПМ B-6306. Препарат обладает высокой эффективностью против жесткокрылых насекомых, удобными эксплуатационными качествами, а также является экологически безопасным из-за отсутствия термостабильного экзотоксина. 2 с. п. ф-лы, 6 табл. ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУИзобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, а именно к производству бактериальных средств защиты растений. Изобретение может быть использовано для создания биоинсектицида для борьбы с жесткокрылыми насекомыми вредителями пасленовых культур, вредителями однодольных культур, вредителями запасов. Интенсификация сельского хозяйства обусловила необходимость применения биологических средств защиты растений от вредных насекомых, уничтожающих до 30% урожая. К наиболее опасным насекомым относятся жесткокрылые насекомые, в частности колорадский жук, который поражает картофель, баклажаны, томаты, пьявица вредитель пшеницы, ячменя, ржи, риса, овса. Для борьбы с жесткокрылыми насекомыми используются, в основном, химические инсектициды, они достаточно эффективны, но не обладают специфичностью, загрязняют окружающую среду, накапливаются в почве, воздухе, воде. В качестве альтернативных используются биологические инсектициды "Битоксибациллин", "Боверин" [1, 2] Однако препарат "Боверин" на основе грибного штамма-продуцента малоэффективен и для достижения экономически обоснованного снижения численности вредителя требуются добавки химических инсектицидов. Действующим началом бактериального препарата "Битоксибациллина" является термостабильный экзотоксин, не обладающий специфичностью и поражающий также нецелевых насекомых, в том числе и полезных, и, кроме того, не являющийся экологически безопасным. Использование штаммов, содержащих экзотоксин, в ряде случаев нецелесообразно и экологически небезопасно из-за того, что он трудно разлагается в почве и способен аккумулироваться в окружающей среде. В настоящее время в мире зарегистрирован биоинсектицид "Новодор" (Дания) [3] в качестве штамма продуцента использован Bac. thuringiensis var. tenebrionis, синтезирующий белковый эндотоксин, специфически активный против жесткокрылых насекомых. Аналогов данному препарату в Российской Федерации и странах СНГ нет. На территории бывшего СССР биоинсектициды производились в виде смачивающегося порошка, обладали рядом недостатков, среди которых неоднородность морфометрического состава частиц, плохая растворимость и нестабильность рабочих суспензий, недостаточная растекаемость и смачиваемость поверхности листьев. Наиболее близким техническим решением (прототипом) к предлагаемому изобретению является способ с использованием штамма Bacillus thuringiensis supsp. tenebrionis DSM 2803 [4, 5] синтезирующего кристаллический белковый эндотоксин, обладающий летальным действием против колорадского жука [6] Однако по некоторым основным технологическим характеристикам, таким как время ферментации, способность к росту в обедненной среде, уровень спонтанной индукции фага, штамм-прототип DSM 2803 обладает существенными недостатками, в частности длительным временем культивации (72 часа). Кроме того, при получении токсического материала используется дорогая многокомпонентная среда. Для штамма-прототипа характерен спорадический лизис культуры в жидкой и на плотной питательной среде в результате спонтанной индукции фага. Цель настоящего патента получение штамма-продуцента биоинсектицида, обладающего высокими технологическими характеристиками, и создание на его основе препарата, обеспечивающего эффективную защиту от вредных жесткокрылых насекомых. Эта цель достигается использованием в качестве продуцента штамма Bacillus thuringiensis H8 ВНИИгенетика 16-816 (ВКПМ B-6306), синтезирующего белковый кристаллический эндотоксин, летальный для широкого круга жесткокрылых насекомых колорадского жука, щавелевого листоеда, пьявицы красногрудой. Заявляемый штамм имеет следующие характеристики: 1. Культурально-морфологические признаки. Грамположительные подвижные палочки, размером 1,2 1,6 x 2,5 3,0 мкм. Образуют споры и кристаллические включения в основном квадратной формы. На агаризованных средах через 24 часа роста при 30oC образует колонии размером 3 4 мм с гладкой поверхностью. При культивировании в жидких питательных средах при аэрации штамм растет равномерно по всему объему. При росте в богатых питательных средах -дрожже-полисахаридная (ДПС), дрожжевая споро- и кристаллообразование завершаются к 46-48 часу культивирования при 30oC. Титр термоустойчивых спор при культивировании в среде ДПС 3 4 млрд. спор /мл, при росте в дрожжевой среде 1,5 2,3 млн. спор/мл. При культивировании наблюдается крайней редкий спонтанный выход фага. 2. Физиолого-биохимические признаки. Штамм 16-816 не сбраживает маннозу, салицин, эскулинн; лецитиназу не образует; гидролизует крахмал; сахарозу сбраживает. Штамм усваивает ионы аммония и глутаминовую кислоту. Режим культивирования 28 34oC, оптимум роста- 30oC. Значения pH питательной среды для оптимального культивирования 6,8 7,0. Штамм термостабильный экзотокин не синтезирует. 3. Генетические характеристики. В клетках штамма 16-816 содержатся экстрахромосомальные элементы (плазмиды) с молекулярными массами (в кв): 60, 40 и 10. Генетические детерминанты токсинообразования локализованы на плазмиде с мол. весом 6 кв. Штамм устойчив к пенициллину 100 мкг/мл, полимиксину -100 мкг/мл. Кристаллы штамма состоят из белков с молекулярными массами- 73, 68 и 65 кДа (возможно, два последних белка являются продуктами распада белка 73 кДа). 4. Инсектицидные свойства. Штамм высоко активен против жесткокрылых насекомых, в частности против колорадского жука. Инсектицидная активность связана с кристаллическим белковым эндотоксином. Молекулярная масса белкового токсина составляет 73 кДа. Жидкая суспензия, содержащая 10 100 грамм токсического белка на гектар, эффективна для контроля численности личинок колорадского жука I-II возраста. Бионсектицид на основе штамма Bacillus thuringiensis Н8 ВНИИ генетика 16-816 различной препаративной формы далее будут именоваться "Колорадо". 5. Способ получения штамма. Штамм получен методом многоступенчатой селекции. Пример 1. Способ ферментации, концентрирования и получения различных препаративных форм бионсектицида "Колорадо". Для культивирования продуцента используют ферментер вместимостью 300 л. Ферментационную среду готовят, используя питьевую воду. Компоненты среды берутся в расчете на объем среды 150 л. Состав среды, г/л: 1. Кормовые дрожжи (эприн) 15 2. Хлористый кальций 0,1 3. Калий фосфорнокислый однозамещенный 27 4. Гидрат окиси калия 6 5. Пропинол Б -400 1 Для приготовления среды в ферментер заливают 125 135 л воды и при включенной мешалке загружают вышеуказанные компоненты. После перемешивания в течение 15 20 мин объем среды в аппарате доводят водой до 150 л. Величина pH среды перед стерилизацией должна составлять 6,5 7,2. Далее нагревают среду до (123 + 1)oC глухим и острым паром и стерилизуют при этой температуре среду и одновременно ферментер в течение 1 ч при включенной мешалке, поддерживая в рубашке давление 1,5 1,7 ати, в аппарате 1,2 1,4 ати. Засев среды производят в асептических условиях через посевной бачок. После засева отбирают пробу среды для контроля концентрации спор и отсутствия посторонней микрофлоры. Температура поддерживается в аппарате автоматически при помощи системы терморегулирования. Каждые 8 12 ч (а также по мере необходимости) из аппарата отбирают пробу КЖ для микробиологического контроля (состояние культуры, полнота споро- и кристаллообразования и т.д.), а также контроля pH. Начиная с 24 ч роста одновременно образуется споры и кристаллы, причем их соотношение составляет 1: 1; контроль за процессом споро- и кристаллообразования производят светооптическим методом. Продолжительность ферментации 48-56 ч. Процесс оканчивают, когда 50-60% клеток завершило стадию спорообразования, при этом количество аспорогенных клеток в поле зрения при микроскопировании не должно превышать 10% Концентрация жизнеспособных спор в КЖ, получаемой в результате ферментации, составляет не менее 1,6 млн спор/мл. По окончании процесса ферментации КЖ в ферментере охлаждают, продолжая перемешивание и аэрацию, до 18-20oC путем подачи воды в рубашку; после чего начинают подачу КЖ на концентрирование. Концентрирование производят одним из известных способов - сепарирование, центрифугирование, мембранная фильтрация, распылительная сушка. Содержание токсического белка в концентрате должно составлять 40 100 мг/г (40 100 грамм/кг). Концентрат можно использовать для получения инсектицидного препарата различных модификаций. Пастообразный препарат с эмульсионной структурной на основе штамма 16-816, использованного в настоящем патенте, содержит следующие ингредиенты мас. концентрат КЖ вышеупомянутого штамма 50 -55 глицерин 8 10 масло тридекан 20 30 углерод технический 0,2 0,7 спан-60 и неонол 6 8 амбреин 0,1 0,2 Как структурообразователь используется смесь полиспиртов (моно-, ди-, полиглицириды, поливиниловые спирты) с поверхностно-активными веществами в соотношении от 0,5 3:1. В качестве поверхностно-активных веществ используются неионогенные ПАВ, такие как неонол, твины и т.п. или их смесь, а в качестве отдушки применяется амбреин или синтетические душистые вещества. Пастообразный инсектицид получают введением в концентрат 0,3% углерода технического, а на стадии получения готовой формы концентрат растворяют в смеси минерального масла с ПАВ, а затем при перемешивании вводят небольшими порциями в водный раствор структурообразователя, а затем после получения однородной массы в полученную эмульсию вводят отдушку. В ходе проведения процесса по указанной схеме введение в КЖ перед сушкой углерода технического позволяет создать в сгущенной жидкости центры первичного структурообразования ингредиентов, что ведет к образованию в биомассе волокнистой структуры, препятствующей слипанию клеток и обеспечивающей более равномерное нагревание клеток, исключая благодаря этому возможность температурной флуктуации. В дальнейшем при использовании готового препарата сажа играет роль фотопротектора. Полученные в результате сушки "волоконца" под действием растворенного в масле ПАВ разделяются, образуя взвесь, аналогичную дисперсии полимера в растворителе. При попадании в водный раствор под действием комплексов полиспиртов с ПАВ на границе раздела масло-жидкость происходит переход линейных полимеров в сетчатые, что позволяет создать защитную оболочку вокруг находящихся в масляной фазе спор, обеспечивающих их защиту от факторов внешней среды. Полученный препарат по своим эксплуатационным характеристикам обладал активностью, не уступающей химическим инсектицидам, экологически безопасный, на 30 40% устойчивее к внешней среде, чем битоксибациллин, обладал хорошей прилипаемостью, а также приятным запахом. Препарат и технология его получения в просмотренной литературе не описаны. Это в сочетании с вышеизложенными схемой процесса и достигнутыми преимуществами позволяют сделать вывод о соответствии изобретения критериям "Новизна" и "Изобретательский уровень". Полученный препарат представляет собой пасту серого цвета с приятным запахом и хорошей растворимостью в воде (не более 30 сек); 1%-водные суспензии препарата достаточно стабильны. Препараты в форме смачивающихся порошков содержат 5 10% кристаллов штамма 16-816, 25 40% остатков ферментационной среды, каолин или хлористый натрий до 35 50% Пример 2. Испытание штамма Bac. thuringiensis Н-8 Вниигенетика 16-816 на колорадском жуке в лабораторных условиях. Листья картофеля замачивали в различных разведениях культурной жидкости штамма 16-816 (после роста при 30oC 48 час в среде ДПС). После подсушивания листья переносили в чашки Петри и помещали по 10 личинок колорадского жука I II возраста. Каждое разведение испытывали в трех повторностях. Чашки инкубировали при 22oC 3 дня. Результаты представлены в таблице N 1. Пример 3. Испытание штамма Bac.thuringiensis ВНИИгенетика 16-816 на пьявице красногрудой в лабораторных условиях. Листья ячменя замачивали в различных разведениях культуральной жидкости штамма 16-816. После подсушивания листья переносили в чашки Петри и на них помещали по 10 личинок пьявицы младших возрастов. Каждое разведение испытывали в трех повторностях. Чашки инкубировали при 22oC 3 5 дня. Результаты представлены в таблице N 2. Пример 4. Испытание препарата "Колорадо" на колорадском жуке в лабораторных условиях. Ботву картофеля общей площадью 10 кв. см обрабатывали различными концентрациями препарата. Готовили водную суспензию "Колорадо" и соответственно разводили. Листья контрольного варианта обрабатывали водой. Обработанные листья помещали в чашки Петри. В каждую чашку на обработанные листья помещали по 15 личинок I возраста. На каждое разведение использовали 3 чашки по 15 насекомых. Чашки помещали в климатокамеру при 25+1oC и 18-часовом фотопериоде. Опыт учитывали через 72 часа. Результаты представлены в таблице N 3. Пример 5. Полевые испытания препарата "Колорадо" на картофеле в условиях Подмосковья. В условиях опытного хозяйства в Подмосковье на площади в 0,25 га испытывали различные концентрации "Колорадо" против личинок колорадского жука I II возраста на картофеле. Обработку проводили ручным опрыскиванием при норме расхода рабочей жидкости 500 л/га. Оценку проводили на 25 учетных растениях. В качестве дополнительных контролей использовали "Битоксибациллин" и химический инсектицид "Децис". Результаты представлены в таблице N 4. Пример 6. Полевые испытания препарата "Колорадо" на картофеле в условиях Белоруссии. В условиях хозяйства в Белоруссии на участках по 1 га испытывали препарат "Колорадо" против личинок колорадского жука I II возраста на картофеле. Обработка проводилась тракторным опрыскивателем, расход рабочей жидкости 400 л/га. Результаты представлены в таблице N 5. В качестве дополнительного контроля использовали химический инсектицид "Карате". Пример 7. Испытание "Колорадо" против личинок колорадского жука на картофеле в условиях защищенного грунта. В условиях защищенного грунта в опытном хозяйстве в Подмосковье испытывали "Колорадо" на личинках колорадского жука I II возраста. Обработку проводили ручным опрыскивателем, при расходе рабочей жидкости 500 л/га. Результаты представлены в таблице N 6. Литература 1. Кандыбин Н.В. с соавт. Новые экзотосигенные штаммы Bacillus thuringiensis. В сб. Бактериальные средства и методы борьбы с вредными насекомыми и грызунами. Л. Колос, 1972, с. 20 23. 2. Лаппа Н.В. Гораль В.М. Способ получения энтомопатогенного препарата боверина. Авт. свид. СССР N 394424 (1973). 3. Rugh S. Use of a Coleopteran astive Bacillus thuringiensis for controlling the cereal leaf beetle Oulema melanopa. WO 91/14369. 4. Krieg V. A. at al. Bacillus thuringiensis var. tenebrionis a new pathotype effective against larvae of Coleoptera. Z. And. Entomol. 1983, 96 500 508. 5. Криг В.А. с соавт. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. tenebrionis для производства инсектицидного препарата против насекомых Coleopteran spp. Авт. свид. СССР N 14489995 A3. 6. Herrnstadt C. Wilcox E. Cloning and expression of Bacillus thuringiensis toxin gene encoding a protein toxic to beetles the order Coleopteran. US Patent N 4771131.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Инсектицидный препарат против жесткокрылых насекомых, включающий активное начало концентрат культуральной жидкости Bacillus thuringiensis и целевые добавки, отличающийся тем, что в качестве активного начала он содержит концентрат культуральной жидкости штамма бактерий Bacillus thuringiensis ВКПМ В-6306, а в качестве целевых добавок глицерин, масло тридекан, углерод технический, спан-60, неонол и дополнительно отдушку амбреин при следующем соотношении компонентов, мас. Концентрат культуральной жидкости штамма бактерий Bacillus thuringiensis ВКПМ В-6306 50 55 Глицерин 8 10 Масло тридекан 20 30 Углерод технический 0,2 0,7 Спан-60 и неонол 6 8 Амбреин 0,1 0,2 2. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis ВКПМ В-6306, используемый для получения инсектицидного препарата против жесткокрылых насекомых, в частности, против колорадского жука, пьявицы красногрудой и щавелевого листоеда.Популярные патенты: 2253239 Способ производства средства для обработки растений (варианты) ... периодически сбрасывают до значения, обеспечивающего вскипание экстрагента, и повышают до исходного значения.14. Способ производства средства для обработки растений, предусматривающий экстрагирование биомассы микромицета в постоянном или переменном магнитном поле жидким экстрагентом, выбранным из группы, включающей низшие спирты, предельные или непредельные углеводороды, содержащие до 10 атомов углерода в молекуле, их галогенпроизводные, инертные газы, азот, закись азота, двуокись углерода и их смеси, отделение экстракта и введение в него неактивных компонентов с получением целевого продукта, отличающийся тем, что используют биомассу микромицета Mortierella hygrophila, а в ... 2121787 Устройство для регулирования температуры воздуха в теплице ... температурой наружного воздуха и теплоносителя определяются в каждом конкретном случае в зависимости от климатической зоны и конструктивных решений систем отопления. При повышении температуры теплоносителя выше +15oC (условно) проходной регулирующий клапан 39 закрыт, и, наоборот, при температуре теплоносителя ниже +15oC (должна работать система кровельного отопления) клапан 39 автоматически открыт и начинает работать трехходовой смесительный клапан 6 в автоматическом режиме. Процесс включения и выключения системы кровельного отопления часто повторяется в течение суток в зависимости от периода года. Выходной сигнал датчика 15 температуры теплоносителя кровельного отопления ... 2227965 Способ возделывания бахчевых культур и устройство для его осуществления ... недостаткам данного устройства относятся ограниченные функциональные возможности и низкое качество обработки почвы в междурядьях. Рассматривая конструкцию и выполняемый ею технологический процесс применительно для возделывания бахчевых культур в условиях юга России следует отметить то, что сорняки в рядках не уничтожаются, а плети повреждаются. Для уничтожения сорной растительности в междурядьях необходимо прежде всего убрать плети бахчевых культур.Известно устройство для прополки, содержащее установленные на раме посредством приводного вала и расположенные под углом друг к другу рабочие органы, рабочие поверхности которых выполнены с рифлениями для взаимодействия друг с другом, в ... 2239968 Способ предпосевной обработки семян овощных культур ... придавливают деревянной крышкой ниже уровня раствора на 5-10 см. После выдержки семян в растворе бишофита раствор сливают в порожнюю емкость. Семена высаживают в специально подготовленные торфоперегнойные ящики (стаканчики, капсули) и выращивают в тепличных условиях для получения рассады.В табл.1-5 представлены экспериментальные данные влияния предпосевной обработки семян овощных культур бишофитом на посевные качества семян. Так, в результате описанной предпосевной обработки с увеличением концентрации бишофита (от 15 до 100 мас.%) у семян капусты сорта Аматер 611, редиса сорта Розовый с белым носиком, перца сорта Калифорнийское чудо, огурца сорта Конкурент и лука сорта Каратальский ... 2120753 Способ получения пестицидного водного суспензионного концентрата и пестицидный водный суспензионный концентрат ... концентрат, содержащий частицы активнодействующего вещества среднего размера более 1 мкм оказывается, по существу, безвредными для культурных растений, но проявляет биологическое действие, которое слабее биологического действия эмульгируемого концентрата, то есть суспензионный концентрат необходимо использовать в дозах, которые в 4 - 8 раз превышают дозы эмульгируемых концентратов. Что касается этих проблем, то было предложено усовершенствовать биологическое действие суспензий путем получения активнодействующего вещества в форме тонкодисперсных частиц. С этой целью были предложены нижеследующие технические решения: (1) способ, при осуществлении которого биологическое действие ... |
Еще из этого раздела: 2282965 Разбрасыватель минеральных удобрений 2482663 Способ мелиорации почвы рисовой оросительной системы к посеву риса 2165141 Тепличный гидропонный комплекс 2199195 Мостовая сельскохозяйственная платформа "сотка" 2475025 Средство для обработки семян зерновых и зернобобовых культур, пораженных фузариозом 2438300 Молочная холодильная установка 2056755 Способ регулирования роста овощных культур 2440712 Автоматизированная система для хранения в поле, возможности оперативного контроля и выгрузки убранных продуктов урожая из уборочной машины 2400963 Передвижной перегрузчик для зерна сельскохозяйственных культур 2274986 Способ посева семян трав и кустарников для создания пастбищ на опустыненных землях и почвообрабатывающее орудие для его осуществления |
Изобретения в сельском хозяйстве
Обработка почвы в сельском и лесном хозяйствах
Посадка, посев, удобрение
Уборка урожая, жатва
Обработка и хранение продуктов полеводства и садоводства
Садоводство, разведение овощей, цветов, риса, фруктов, винограда, лесное хозяйство
Новые виды растений или способы их выращивания
Производство молочных продуктов
Животноводство, разведение и содержание птицы, рыбы, насекомых, рыбоводство, рыболовство
Поимка, отлов или отпугивание животных
Консервирование туш животных, или растений или их частей
Биоцидная, репеллентная, аттрактантная или регулирующая рост растений активность химических соединений или препаратов
Хлебопекарные печи, машины и прочее оборудование для хлебопечения
Машины или оборудование для приготовления или обработки теста
Обработка муки или теста для выпечки, способы выпечки, мучные изделия
|
|
||