Способ определения биологической активности -эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis

Международная патентная классификация:       A01N C12Q

Патент на изобретение №:      2051971

Автор:      Юдина Т.Г., Егоров Н.С.

Патентообладатель:      Юдина Татьяна Георгиевна

Дата публикации:      10 Января, 1996

Адрес для переписки:      подача заявки03.12.1991 публикация патента10.01.1996

Изображения

Использование: микробиологическая промышленность, определение биологической активности d - эндотоксинов. Bacilluc thuringiensis. Сущность изобретения: берут суспензию спор и кристаллов Bac. thuringiensis, промывают водой, раствором поваренной соли, смесью ацетона с водой в соотношении 2 : 3, удаляют нерастворимые компоненты центрифугированием, затем кристаллы растворяют щелочью NaOH, осаждают d - эндотоксины добавлением уксусной кислоты при pH 4,0 - 6,5. Полученный осадок растворяют в буфере при pH 8,5 - 9,0, определяют количество белка спектрофотометрически. Отбирают растворы с концентрацией белка 65 - 250 мкг/мл и вносят на агаризованные среды, засеянные тест - микроорганизмом, например, Micrococcus flavus, Aspergillus terreus инкубируют, определяют антибактериальную активность и по ней судят о биологической активности. 1 табл.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

Изобретение относится к способам определения биологической активности различных Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -эндотоксинов гликопротеинов параспоральных кристаллов B.thuringiensis и может быть применено в микробиологии, биотехнологии.

Известен способ определения биологической активности параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, токсичных для жесткокрылых насекомых, путем скармливания личинкам колорадского жука Leptinotarsa decemineata I возраста дисков из листьев картофеля, смоченных суспензией кристаллов различной концентрации, и оценки ЛК50 через определенный промежуток времени (3 сут). Метод требует использования личинок определенных насекомых единственной стадии развития, высокочувствительных к данному Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -эндотоксину, а также листьев картофеля, может применяться для определения биологической активности Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" >-эндотоксинов только одного патотипа -С.

Способ имеет следующие недостатки: 1, Невысокая экономичность способа.

2. Невысокая чувствительность способа.

3. Сезонность применения способа из-за трудности выращивания тест-объектов и корма для них в определенное время года.

Известен способ определения биологической активности параспоральных кристаллов B.thuringiensis subspp. insectus, galleriae, alesti, dendrolimus, токсичных для чешуекрылых насекомых, основанный на регистрации уменьшения привеса гусениц Galleria mellonella, получающих Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -эндотоксины вместе с кормом. Кристаллы растворяют в щелочи, определяют концентрацию белка в растворе по методу Лоури, добавляют к сухому корму для гусениц раствор белка, взвешивают гусениц через 1,2,5 сут, учитывая уменьшение их привеса по сравнению с контролем из-за прекращения питания под действием Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" >-эндотоксинов.

Способ имеет следующие недостатки: 1. Длительность и громоздкость способа.

2. Невысокая экономичность способа.

3. Ограниченность применения способа определением биологической активности растворов параспоральных кристаллов патотипа А.

4. Невысокая точность способа, не учитывающего изменение специфичности действия различных

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -эндотоксинов на разных насекомых.

Известен способ определения биологической активности

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" >-эндотоксинов кристаллов B.thurindiensis, токсичных для чешуекрылых насекомых, путем определения антибактериальной активности их растворов, который целесообразно принять за прототип. Промытые кристаллы (можно в смеси со спорами) растворяют в щелочных условиях в буфере с роданидом калия и дитиотреитолом, высокомолекулярную фракцию очищают гель-фильтрацией и вносят в агаризованную среду для роста тест-микроорганизма в лунки; определяют зоны подавления роста через 36-48 ч пребывания агара во влажной камере и последующей 15-24-часовой инкубацией при 30оС.

Прототип имеет следующие недостатки: 1. Длительность и громоздкость способа.

2. Невысокая экономичность способа.

3. Ограниченность применения способа определением биологической активности параспоральных кристаллов патотипа А.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение и ускорение, повышение экономичности способа, расширение границ его применения.

Цель достигается тем, что параспоральные кристаллы B.thuringiensis патотипов А и С, полученные при выращивании культур эндомопатогенных бактерий (например, B.thuringiensis sspp. thuringiensis, kurstaki, dendrolimus, galleriae, alesti, tenebrionis и др.) на средах любого известного состава, отмывают от адсорбированных на их поверхности примесей водой, IM NaCl, смесью ацетон: вода (2:3) и снова дистиллированной водой. Затем кристаллы (можно в смеси со спорами) растворяют в 0,015-0,035 н.NaCl 1 ч при комнатной температуре с перемешиванием (на качалке при 250 об./мин), осаждают Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -эндотоксины из подкисленного уксусной кислотой до рН 4-6,5 супернатанта центрифугированием (при 12-15 тыс.об./мин 20 мин) на холоду, осадок перерастворяют в буфере (например, 0,01 М фосфатно-цитратном) при рН 8,5-9, немедленно устанавливают количество Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -эндотоксинов в единице объема исследуемого образца спектрофотометрически, определяют и сравнивают биологическую активность растворов Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" >-эндотоксинов с известной концентрацией по скорости агрегации клеток тест-микроорганизма (предварительно выращенного в питательной среде с добавлением 0,1-1% полиэтиленгликоля 600 и 5 Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" >10-4-10-3 М ЭДТА) в буфер или методом диффузии в агар с 0,2-0,4% твина.

Так, из данных, представленных в таблице видно, что предлагаемый способ позволяет определять и сравнивать в течение от нескольких часов до одних суток биологические активности Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" >-эндотоксинов B.thuringiensis патотипов А и С, благодаря тому, что Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" >-эндотоксины влияют на клетки микроорганизмов не с такой высокой специфичностью, как на клетки насекомых, хотя природа действия Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -эндотоксинов на клетки разных тест-объектов одинакова (4, 5).

Метод удобно и выгодно применять при контроле биологической активности основных токсикологических компонентов бактериальных инсектицидов Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" >-эндотоксинов, в процессе их разработки, производства, хранения.

П р и м е р 1. Берут 5 мл суспензии спор и кристаллов B.thuringiensis ssp. dendrolimus, полученных при выращивании бактерий на среде, содержащей 2,5% дрожжей БВК и 2,5% кукурузной муки. Остатки твердых компонентов среды осаждают центрифугированием при 2 тыс. об./мин. 3 мин. Кристаллы отделяют от спор известным способом, промывают в воде, 1 М NaCl, смеси ацетон:вода (2:3) и снова в воде 3 раза. При промывании кристаллы осаждают центрифугированием при 12 тыс. об/мин. 10 мин. Промытые кристаллы помещают в колбу с 50 мл 0,015 н.NaOH, растворение проводят при комнатной температуре на качалке (250 об. /мин. ) 1 ч. Из супернатанта после центрифугирования при 12 тыс. об/мин. 20 мин осаждают Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -эндотоксины путем подкисления до рН 4 уксусной кислотой, выдерживают при 4оС 15 мин, осаждают при 12 тыс.об./мин. 30 мин с охлаждением. Осадок растворяют в 0,01 М фосфатно-цитратной буферной системе рН 8,5 и определяют количество белка спектрофотометрически. Затем из исходного раствора получают путем разведения в таком же буфере растворы с поглощением в УФ-области при 280 нм 0,2; 0,1; 0,05, что соответствует примерно концентрации Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -эндотоксинов 250, 130, 65 мкг/мл. Эти растворы вносят по 20 и 40 мкл в заранее подготовленные подсушенные лунки в агаризованном разбавленном в 3 раза бульоне Хоттингера с 0,2% твина, засеянном газоном тест-микроорганизма Micrococcus flavus, оставляют при комнатной температуре на 4-6 ч, затем инкубируют при 37о 16 ч и определяют антимикробную активность по диаметру зон подавления роста тест-микроорганизма. Выражают антимикробную активность в относительных единицах, равных отношению диаметра подавления роста тест-микроорганизма к количеству белка Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" >-эндотоксинов. Удельная антимикробная активность (отн.ед./мг) отражает активность смеси Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -эндотоксинов кристаллов, выраженную на мг белка, а общая количество антимикробной активности в единице объема. Изменение удельной антимикробной активности обусловлено тем, что в состав кристаллов входят в различных соотношениях различные Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -эндотоксины, а также могут входить разные количества неактивных белков.

До засева в газон бактерии выращивают 16-20 ч на агаризованной среде Хоттингера с добавлением 0,1% ПЭГ-600 и 5 Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" >10-4 М ЭДТА, затем смывают 0,005 М фосфатно-цитратным буфером рН 7,5 и используют для определения антибактериальной активности. В таблице приводятся данные, полученные при усреднении значений для 3 концентраций растворов в 3 повторностях.

П р и м е р 2. Берут суспензию спор и кристаллов B.thuringiensis subsp. tenebrionis, полученную так, как описано в примере 1, промывают так, как описано в примере 1, растворяют (без отделения спор) в 0,035 н.NaOH так, как описано в примере 1. Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -Эндотоксины осаждают из супернатанта уксусной кислотой при рН 6,5, центрифугируют на холоду при 15 тыс.об./мин, 20 мин, осадок перерастворяют в 0,05 М трис-HCl буферном растворе рН 9. Количество белка и антибактериальную активность определяют так, как описано в примере 1, кроме следующих отличий: а) тест-микроорганизм подращивают в присутствии 0,5% ПЭГ-600 и 10-3 М ЭДТА; б) в агар для определения вносят 0,4% твина. Результаты приведены в таблице.

П р и м е р 3. Берут по 3 мл суспензии спор и кристаллов B.thuringiensis подвидов kurstaki и tenebrionis, полученных и промытых так, как описано в примере 1. Растворяют в присутствии 0,02 н.NaOH так, как описано в примере 1, осаждают уксусной кислотой, доводя рН растворов до 4 (для подвида kurstaki) и 6,5 (для подвида tenebrionis). Осадки перерастворяют в 0,05 М фосфатно-цитратной системе рН 8,7; устанавливают количество Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" >-эндотоксинов в 1 мл и определяют антибактериальную активность так, как описано в примере 1, в агаризованном разведенном в 3 раза бульоне Хоттингера с добавлением 0,3% твина. Тест-микроорганизм подращивают перед определением антибактериальной активности Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" >-эндотоксинов в присутствии 0,5% ПЭГ-600 и 10-3 М ЭДТА ( что повышает его чувствительность к действию Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" >-эндотоксинов на 30-70%). Значения, приведенные в таблице, показывают, что в данном опыте удельная антибактериальная активность Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" >-эндотоксинов подвида tenebrionis примерно в 4 раза выше, чем таковая подвида kurstaki. Такое сравнение биологических активностей Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -эндотоксинов патотипов А и С, необходимое при многих исследованиях, можно проводить только предложенным способом.

П р и м е р 4. Берут кристаллы B.thuringiensis ssp. kurstaki, полученные при выращивании бактерий на среде, содержащей (в г/л): MgSO4 0,3; MnSO4 0,05; CaCl2 0,165; ZnSO4 0,0035; FeSO4 0,0005; CuSO4 0,005; K2HPO4 0,25; (NH4)2SO4 2,0; крахмал 10; сорбит 10; триптон 5,0; рН 7,2. Промывание кристаллов проводят так, как описано в примере 1. Растворение кристаллов проводят в 0,035 н.NaOH так же, как описано в примере 1. Определяют антибактериальные действие полученного раствора по изменению оптической плотности суспензии M. flavus в 0,01 М фосфатно-цитратном буфере рН 7,5 через 1, 5, 10, 30 мин по сравнению с контролем. Полученный результат, выраженный в относит. ед. представлен в таблице.

П р и м е р 5. Берут кристаллы B.thuringiensis subsp. kurstaki, полученные и промытые так, как описано в примере 1. Растворение кристаллов проводят в 0,02 н.NaOH так же, как описано в примере 1 определяют антимикробную активность Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -эндотоксинов по действию на Aspergillus terreus методом диффузии в агаризованной среде Чапека-Докса раствора Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -эндотоксинов, нанесенных на диски. Полученные значения антибиотической активности приведены в таблице.

П р и м е р 6. Берут кристаллы B.thurinsiensis subsp. galleriae, полученные и промытые так, как описано в примере 1. Растворяют их (можно в смеси со спорами) в 0,06 н.NaOH так, что описано в примере 1. Определяют биологическую активность Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -эндотоксинов так, как описано в примере 1. В качестве тест-объекта используют клетки M. flavus, предварительно не росшие в присутствии ЭДТА и ПЭГ-600. Получают значения антибактериальной активности меньшие, чем при выполнении приведенных условий определения.

П р и м е р 7. Растворение всех кристаллов подвидов B.thuringiensis, используемых в работе, в 0,005 н.NaOH не приводит к достаточному полному выходу Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -эндотоксинов, поэтому проведение всех остальных операций, описанных в примере 1, дало возможность получить значительно более слабые значения биологической активности Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" >-эндотоксинов.

Использование предлагаемого способа имеет следующие преимущества: 1. Ускорение, упрощение, повышение экономичности.

2. Возможность сравнения биологической активности Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -эндотоксинов разных патотипов B. thuringiensis с помощью одного тест-организма. Других способов сравнения биологической активности Способ определения биологической активности <img src=

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -эндотоксинов патотипов А и С пока неизвестно.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

-эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis, патент № 2051971" SRC="/images/patents/421/2051145/948.gif" > -ЭНДОТОКСИНОВ РАЗЛИЧНЫХ ПАТОТИПОВ BACILEUS THURINGIENSIS, предусматривающий растворение кристаллов щелочью, удаление нерастворимых компонентов, определение количества белка в растворе, добавление раствора на агаризованную среду, предварительно засеянную тест-микроорганизом, инкубирование смеси, определение антибактериальной активности, по которой судят о биологической активности d-эндотоксинов, отличающиеся тем, что перед растворением кристаллы последовательно промывают водой, раствором поваренной соли и ацетоноводной смесью в соотношении 2 : 3, после удаления нерастворимых компонентов из раствора эндотоксины осаждают уксусной кислотой при рН 4,0 - 6,5, полученный осадок растворяют в буфере при рН 8,5 - 9,0, а на агаризованную среду вносят растворы с концентрацией белка 65 - 250 мгк/мл.

Популярные патенты:

2078495 Устройство для транспортирования кормов в хранилищах башенного типа

... ремня, по всей длине контура, кордовую нить на ширине 6 6,5 мм не прокладывать. Эту часть ремня оставлять под вулканизацию в теле ремня, крепежных деталей болтов. Но можно эту задачу решить и по другому. В середине сечения ремня оставлять безкордовую полоску под отверстия для установки крепежных деталей. Для производителя клиновых ремней эта задача решается доступно, без доработки технологии и без переналадки оборудования. Комбинированные транспортеры с рабочими элементами: граблина, скребок, щетка надежность работы которых при подъеме кормовой массы на значительную высоту безупречна, при этом могут поднимать корм вертикально или под очень острым углом, что позволит значительно ...

2171570 Устройство для группового учета надоев молока при доении

... колоколом, необходимое для создания подъемной силы, большей силы тяжести поплавка; при продувке дозы воздух из-под колокола прорывается через слой молока, вызывая дополнительное насыщение молока воздухом со всеми отрицательными последствиями; погрешность формирования дозы зависит от стабильности вакуумметрического давления, так как при его колебании изменяется и остаточное давление, действующее на сферическое дно колокола сверху. Наиболее близким устройством к заявленному изобретению по совокупности признаков является вакуумно-весовой счетчик, представленный на фиг. 1 (Астахов А.С. Измерительные устройства для учета количества молока в потоке и эффективность их применения на фермах ...

2259028 Устройство для безотвальной обработки почвы

... от поломки в момент опускания устройства для работы.Таким образом, решается задача повышения эксплуатационной надежности, расширения технологических возможностей и экономии энергозатрат. Формула изобретения 1. Устройство для безотвальной обработки почвы, включающее двухбрусную раму с приваренными в шахматном порядке, парными, с двумя сквозными отверстиями пластинами, между которыми болтами закреплены рабочие органы в виде вертикальных с прямоугольным сечением стоек, содержащих установленные под углом стрельчатые лапы, составленные из двух плоских треугольников, имеющих верхнюю заточку, а под заточкой наплавленный слой сормайта, расставленных симметрично и с зазором, ...

2270545 Посевной комбинированный агрегат

... содержащем трактор, бункер с высевающими аппаратами, семяпроводы и сошники, выполненные в виде двух пересекающихся лопастей с углами раствора меньше 90° и установленные с равным шагом на поверхности катка, согласно изобретению каждый сошник, установленный с возможностью демонтажа в пазах на поверхности катка, выполнен в виде пары оппозитно смонтированных пересекающихся лопастей с прорезами на торцевых гранях, сопрягаемых с пазами на поверхности катка, при этом обе пары лопастей зафиксированы в пазах посредством клина, размещенного в дополнительных пазах лопастей над поверхностью катка.Изобретение поясняется чертежами.На фиг.1 схематично представлен посевной ...

2264065 Способ возделывания сельскохозяйственных культур на корм

... смеси эти показатели составляли, соответственно, 248 и 3,8. Следует заметить, что при уборке ячменно-гороховой смеси в фазе колошения злакового компонента расход обменной энергии составлял 596 МДж/ц сухой биомассы, а коэффициент энергетической эффективности падал до 1,8.После уборки ярового ячменя в широкорядных посевах донника проводили междурядную обработку, а осенью в оптимальные сроки поперек рядков сеяли тритикале с нормой высева 3 млн. всхожих семян на 1 га. В качестве контроля высевали одновидовой посев тритикале и его смесь с озимой викой. Весной возобновлял вегетацию сначала тритикале, и только через 7-10 дней начинал отрастать донник. Поэтому в начальный период ...

Еще из этого раздела:

2175189 Способ регенерации растений сорго в культуре in vitro

2272399 Зерноуборочный комбайн

2387128 Система сбора отходов для отделения жидких отходов от твердых отходов

2391804 Почвообрабатывающий каток

2129787 Инсектицидная композиция

2019938 Рабочий орган почвообрабатывающей машины

2137365 Способ отпугивания биологических существ

2154629 Производные оксима, способ их получения, фунгицидное средство и способ борьбы с грибковыми заболеваниями

2476068 Фильтр для использования при переработке пищевых продуктов

2025945 Способ выращивания насаждений сосны

Изобретения в сфере сельского хозяйства, животноводства, рыболовства

Способ определения биологической активности -эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis

Изображения

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ